限制性内切酶（restriction endonucleases，RE）是最重要的工具酶之一。它是一类核酸水解酶，能识别和切割双链DNA分子中的特定核苷酸序列。
（一）命名原则
限制性内切酶大多从细菌中发现，根据来源进行命名，限制酶的第一个字母（大写，斜体）为宿主菌的属名，第二、第三个字母（小写，斜体）代表宿主菌的种名缩写，第四个字母（斜体）是株或型，最后的罗马数字表示同株内发现和分离的先后顺序。如从流感嗜血杆菌中分离到的几种限制性内切酶分别命名为HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ等等。
（二）分类
根据酶的结构、作用的不同，可将限制性内切酶分为三种类型。Ⅱ型限制性内切酶具有高度特异性的DNA裂解点,而Ⅰ型和Ⅲ型兼有修饰（甲基化）作用和依赖于ATP的活性，但不能在识别序列上直接裂解DNA，故用途较少。因此，Ⅱ型限制性内切酶是基因工程和基因诊断中重要的工具酶，通常不特别说明的即为Ⅱ型限制性内切酶。
（三）限制性内切酶的功能
限制性内切酶识别位点以双链DNA分子的4～8个特异性核苷酸顺序为多见，其中6个核苷酸顺序最常见。酶解后5′末端为磷酸基，3′末端为羟基。限制性内切酶的识别序列一般具双重对称性，切口共有三种类型：①5′末端突出型；②3′末端突出型；③平末端型。例如EcoRI识别序列为GAATTC，酶水解发生在GA之间，产生错开的5′突出末端；PstI的识别序列为CTGCAG，水解发生在AG之间，产生错开的3′突出末端；而HpaI识别序列为GTTAAC，水解发生在TA之间，产生不错开的平末端（blunt end）。错开突出的单链末端，很容易与互补的单链末端配对“粘合”起来，因此称为粘末端（cohesive end）
限制性内切酶切口类型
限制性内切酶 识别序列 酶切位点 末端类型
EcoRI 5′－GAATTC－3′ 5′－G AATTC－3′ 5′端粘末端
3′－CTTAAG－5′ 3′－CTTAA G－5′
PstI 5′－CTGCAG－3′ 5′－CTGCA G－3′ 3′端粘末端
3′－GACGTC－5′ 3′－G CGTC－5′
HpaI 5′－GTTAAC－3′ 5′－GTT AAC－3′ 平末端
3′－CAATTG－5′ 3′－CAA TTG－5′
来源不同但能识别和切割同一位点的酶称为同工异源酶（isoschizomer）。如BamHI和BstⅠ(G↓GATCC),Xho和PaeR7(C↓TCGAG)，这些同工异源酶可以互相代用。
另有些限制性内切酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些酶称为同尾酶（isocaudarner）。例如BamHI(G↓GATCC)和Sau3AI(N↓GATCN)，由此产生的DNA片段可通过粘末端相互连接，使DNA重组有更大的灵活性。
（四）反应条件
限制性内切酶种类很多，来源不同，但反应条件都很相似。
表7-2 限制性内切酶的一般反应条件
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条件 |
反应类型 |
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分析用 |
制备用 |
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反应体积 DNA 限制性内切酶用量 Tris-HCl(pH7.5) MgCl2 β-巯基乙醇 牛血清白蛋白 NaCl 保温时间 反应温度 |
20～100μl 0.5～1ml 0.1～10μg 10～30μg 1～5U/μgDNA 1～5U/μgDNA 20～50mmol 50mmol 5～10mmol 10mmol 5～10mmol 5～10mmol 50～500μg/ml 200～500μg/ml <5% <5% 按需要 按需要 |
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（五）DNA的甲基化作用
许多细菌有限制与修饰系统，该系统使外来的DNA降解，而对于自身的DNA则加以修饰不被降解。Ⅱ型限制性内切酶不具甲基化作用，这一功能由相应的修饰酶承担，它们识别同一DNA顺序而发挥作用不同，例如PstI限制酶和PstI甲基化酶均识别5′－CTGCAG－3′，前者切割5′－CTGCA↓G－3′，后者使A甲基化，形成5′－CTGCmAG－3′，甲基化后则被保护而不为PstI限制酶切割。
大多数E.coli中含有两种可使DNA甲基化的酶：dam甲基化酶和dcm甲基化酶。dam甲基化酶识别5′－GATC－3′，使A的N6位甲基化形成5′－Gm6ATC－3′，如限制性内切酶Bcl识别顺序为5′－TGATCA－3′，BclI dam甲基化酶作用后的TGm6ATCA就不能被Bcl I 切割了。dcm甲基化酶识别5′－CCWGG－3′（W为T或A），并使一个C→m
（六）应用及注意事项
在分子生物学领域，限制性内切酶占有举足轻重的地位。其主要用途如下：①改造和组建质粒；②组建基因组DNA物理图谱；③基因组DNA同源性研究；④DNA重组克隆及亚克隆；⑤DNA杂交与序列分析。
限制性内切酶活性单位规定如下：在适当的温度、pH和离子强度等条件下，1小时内完全分解1μg特异DNA底物所需的限制性内切酶量，定义为1个活性单位。酶的质量是至关重要的，好的限制性内切酶应不存在任何核酸内切酶和外切酶的污染，长时间酶解不出现识别顺序特异性的下降。
限制性内切酶在非标准反应条件下，能切割一些与其特异识别顺序类似的序列，酶的特异性降低，这种现象称为星号活力，一般在限制性内切酶的右上角加一个*表示。如EcoRI*代表EcoRI的星号活力，当在高pH或低盐离子强度条件下，EcoRI的识别顺序由5′－G↓AATTC－3′变为5′－N↓AATTN－3′；另一种情况是对AATT中的A、T分辨不严格，故实验时应防止星号活力产生。诱发星号活力出现的原因有：①反应体系中甘油含量高（>5%，V/V），应使用最小酶量避免；②限制性内切酶用量过大（大于100U/μgDNA）；③低离子强度（小于25mmol/L）；④高pH环境，如pH8.0，一般建议用pH7.0的缓冲液；⑤含有机溶剂（如二甲基亚砜、乙醇、二甲基乙酰胺等）；⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二阶阳离子存在。常易发生星号活力的酶有：EcoRI、HindⅢ、PstI、SalI以及HinfI等。
