血小板功能的检测包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力。然而，在血小板相关疾病的诊断中，检测血小板功能的方法常常是有争议的。这通常是由于方法本身的原因造成的^［1］，譬如，静脉阻滞、抗凝剂选择、离心，甚至标本处理不当等因素，都可导致医源性血小板激活，影响临床诊断的价值。这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便，最好可用于临床常规检测血小板功能测定方法。
 　　由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断，近年来，文献报道利用流式细胞术，特别是全血法流式细胞术，检测血小板膜糖蛋白的表达^［2］。该技术能灵敏、特异地检测血液中活化血小板，并评价其功能。现就全血法流式细胞术检测血小板功能的方法及临床应用现状和潜力进行综述。
 　　一、全血法流式细胞术
 　　1.方法学：流式细胞仪能快速测定大量个体细胞的特性。样品中欲分析的细胞预先进行荧光标记，然后由压缩氮经硅管送达标本室，再以5 000～10 000个细胞/秒的速率逐个射入光敏感区。在适当波长的激发光作用下，被特殊染色的细胞发射出一定量的荧光脉冲讯号。探测器收集每个细胞的荧光讯号和光散射，然后传入计算机进行分析。
 　　传统的流式细胞术检测血小板膜糖蛋白的表达，常用的样本是经洗涤的血小板或富含血小板的血浆。由于血小板极易活化激惹，样本经离心、洗涤等步骤，容易人为地导致体外血小板激活，影响临床诊断价值。为此，Shatti等^［2］引入了全血法流式细胞术。该技术能使用全血样本测定循环中血小板的活化状态以及血小板对激活剂的功能应答。
 　　全血流式细胞术样本制备步骤为：
 　　抽血抗凝→稀释→生物素化的检测用单克隆抗体(单抗)→激动剂或缓冲液→固定(1%多聚甲醛)→FITC标记的鉴别用单抗→PE-卵白素→稀释。
 　　稀释样本是为了防止血小板聚集，否则单个血小板上的抗原量就测不出来了，因为流式细胞仪测定的是单个粒子的荧光，而不管这单个粒子是一个血小板还是几个血小板的聚集体。当用凝血酶作外源激动剂时，为防止血小板聚集并形成纤维蛋白凝块，可在全血标本中加入四肽化合物Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP)^［3］。固定这一步若不干扰单抗的结合，生物素化的检测用单抗也可以在固定后加入。血小板鉴别用单抗可在针对血小板特异性膜糖蛋白GPⅠb，GPⅡb，GPⅢa的单抗中任选一种。标记这单抗的荧光试剂可在FITC、PE、PE-CY₅3种荧光染料中任选。
 　　样本随后用流式细胞仪检测。通过荧光极性和特异性光散射鉴别出血小板后，检测5 000～10 000个血小板表面的特异性荧光讯号。检测结果可用两种方法表示。一种是平均颗粒荧光强度，另一种是特异性荧光抗体结合阳性血小板的百分率。阳性血小板百分率法与荧光信号的放大倍数无关，且可以检测受损伤部位血小板亚群的变化。如果检测的是血小板表面某抗原的总量，则荧光强度法更为适合。譬如，在活化状态下，血小板表面GPIb-IX-V复合物含量比静息时低，但降低的幅度小，通常还不足以报告阴性结果^［4］，这时用荧光强度法就比阳性血小板百分率法更合适。
 　　目前传统的流式细胞术还不能定量分析结合位点的绝对数目，但Shatti等^［2］利用¹²⁵I和生物素双标记的单抗进行研究，以PE-卵白素作为荧光结合试剂，发现碘标测定的结合位点数与荧光强度间有线性关系。因此，对于一个特定的单抗，一旦弄清这一线性关系，并知道荧光单抗上荧光素与抗体的摩尔比，就能利用流式细胞仪定量分析该抗体结合位点的绝对数目。目前有一些商品试剂盒能定量测定结合到单个细胞上的抗体数目，但乏见用于血小板的报道。
 　　2.优缺点：与常规血小板功能测定法比，全血法流式细胞术有许多优点。
 　　首先，标本处理的简化能避免血小板体外医源性激活，并防止血小板亚群丢失；循环中的红细胞、白细胞对血小板的活化有影响，因此本法能在最接近受检者体内环境的条件下测定血小板功能。同时，由于使用了血小板鉴别用单抗，检测的仅是血小板，而不会受其它种类细胞或碎片的干扰，保证了检测的特异性。其次，在血栓性疾病中，通常只有小部分的血小板被活化；凝血酶体外活化血小板，也常表现为亚群激活；活化血小板表达CD62等膜糖蛋白也有明显的异质性^［5］。本法能灵敏地检测出少到1%的活化血小板亚群^［6］，尤其是能分析单个或亚群血小板膜上活化标志物的变化，使检测结果更接近真实。若同时使用FITC、PE、PE-CY₅ 3种荧光染料，本法通过三色标志一次能同时检测两个抗原标志物的变化。
 　　此外，做一次检测仅需2 μl血液，这一点，尤其适合于新生儿和血小板减少性疾病患者。本法不使用同位素，没有放射性污染。
 　　全血法流式细胞术也存在不足之处。譬如，流式细胞仪价格高昂，检测费用高，仪器操作复杂。为了避免体外活化，血样需在45分钟内处理，不能久置。另外，流式细胞仪仅检测循环中的血小板功能，而β-TG、PF₄和TXA₂的检测还能反映血管壁上血小板的活化和新近被清除的血小板。虽然存在着这些不足，但本法仍是血小板功能检测的突破性进展。

 

二、全血中活化血小板的检测
 　　1.血小板特异性膜糖蛋白：本法检测血小板功能，首先要对全血中的血小板进行特异性荧光标记，将血小板与血样中其他血细胞区分开来。针对血小板表面特异性膜糖蛋白制备的单抗，使血小板特异性标记成为可能。血小板膜糖蛋白已被深入研究^［7］，表1显示了血小板膜上主要的糖蛋白及其功能。在这些膜糖蛋白中，仅在血小板膜表面表达主要有GPⅠb，GPⅡb，GPⅢa等有限的几种^［8］。根据这些特异性糖蛋白制备的荧光单抗，能在全血中特异性地识别血小板，仅给血小板做上荧光标记。

表1　血小板膜上主要的糖蛋白及其功能

注：vWF血管性假血友病因子；Fb纤维蛋白原；Fn纤维粘连蛋白；Vn体外粘连蛋；LRG富含亮氨酸家族

　　2.活化血小板的标志物：活化血小板与静息血小板相比，其质膜糖蛋白常发生显著的变化，这些变化的糖蛋白便成为活化血小板的检测标志物。　　全血法流式细胞术也是一种免疫学方法，活化血小板表面能通过免疫方法检测的标志物可分为三类^［9］：第一类是血小板颗粒膜上的糖蛋白。血小板被激活时，其颗粒膜与质膜发生融合，颗粒膜蛋白，如CD62、CD63，在质膜上表达，成为活化血小板的分子标志。第二类是血小板质膜表面变化的糖蛋白表位。如GPⅡb/Ⅲa(CD41/61)的PAC1表位^［10］，它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来。因此，使用这个表位的荧光单抗，我们能更精确地在更早阶段检测到血小板的活化。另外，GPIV (CD36)虽然在静息血小板上也表达，但活化血小板上表达量更高^［9］；GPIb-IX-V复合物(CD42)则相反，与静息血小板相比，活化血小板上表达量显著降低^［7］。它们都是活化血小板的分子标志。第三类是出现在活化血小板上能与血小板表面受体相结合的一些抗原，包括纤维蛋白原，Xa因子和thrombospondin等。这些抗原在血小板表面的出现和消失在临床检测上也是有意义的。　　除检测免疫性的分子标志物外，流式细胞术还能检测一些反映活化血小板功能的非免疫性指标。如用Ca²⁺浓度敏感的荧光染料检测胞内Ca²⁺流^［10］，用能进入血小板致密颗粒的荧光染料阿的平来检测活化血小板的释放功能^［11］等。　　3.单抗的选择：与血小板有关的CD单抗有CD9，CD31，CD36，CD41a-b，CD42a-d，CD61，CD62，CD63 ，CD107a-b等。活化血小板的检测需选择针对活化血小板标志物的CD单抗。表2列举了活化血小板检测的一些代表性单抗。

表2　活化血小板CD单抗简介

三、诊断学意义及临床应用
 　　利用全血法流式细胞术检测上述血小板标志物，在许多血小板相关疾病的诊断上有重要的临床应用价值。
 　　1.血栓性疾病：动脉粥样硬化前期血小板沉积，导致心肌梗塞和中风。抗血小板药能降低心肌缺血的发生率，证明心肌缺血与血小板活化有关。全血法流式细胞术检测表明心绞痛和心肌梗塞患者循环中有活化的血小板，血小板活力也增强。冠状窦血液的检测表明，冠状血管成形术会导致血小板活化。如果血流恢复后有高水平的活化血小板，血管可能因为内皮细胞严重损伤或血小板栓塞而发生再狭窄^［12］。因此，活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血事件的危险性。
 　　另外，非风湿性心房纤颤患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化^［13］，胰岛素依赖性糖尿病，子痫前期，外周血管疾病等均可测出血小板活力增加和(或)循环中存在活化血小板，而早产儿的血小板对凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)、TXA₂的体外激活能力降低。
 　　2.血小板缺陷性疾病：全血法流式细胞术提供了一个简单、迅速的方法来诊断血小板膜糖蛋白缺陷性疾病，如巨大血小板综合征，血小板无力症等。前者是由于GPIb-IX复合物先天缺陷所致的血小板形态巨大，功能异常的出血性疾病^［14］。巨大血小板从全血中分离很困难。本法能特异性地识别血小板，省去了分离巨大血小板的步骤，使检测更简便、精确。后者由于GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷，导致血小板聚集功能障碍^［15］。用全血法流式细胞术分析这些分子标志物有助于血小板缺陷性疾病，尤其是不典型病例的诊断。
 　　3.贮存池疾病：原发性贮存池疾病（δ-SPD）常规用血小板聚集法检测，但特异性和灵敏度均不理想。检测血小板致密颗粒的阿的平荧光显微镜法，主观性大，操作繁琐，而且一次检测的血小板数目有限。全血法流式细胞术为δ-SPD的诊断提供了一个简单、迅速的方法，一次能定量检测5 000个以上阿的平染色的血小板。与正常人相比，δ-SPD患者阿的平染色显著下降(从49%降至15%)^［11］。常在骨髓增殖异常综合征和晚期肾衰中出现的获得性致密颗粒贮存池疾病，也能用全血法流式细胞术进行检测和诊断。
 　　4.血小板减少性疾病：破坏过多或生成减少均能导致血小板减少。血小板相关抗体（PAIg）是反映血小板的破坏的指标，虽然其临床意义仍有争议。PAIg的检测有多种方法，但流式细胞术法有其优越性。流式细胞仪能测定单个血小板上的PAIg，只要测定10⁴甚至10³个血小板，在统计学上就能精确地得出PAIg的平均水平，因而用血量少，只要1 ml血液制备的血小板就足够。流式细胞术还能同时测定其他一些反映血小板破坏的指标，如PAIgG、PAIgM、C₃等。血小板的生成与巨核细胞有关，全血法流式细胞术能像检测网织红细胞那样，检测分泌到循环中的“网织”血小板，来判断血小板的生成。“网织”血小板的核酸水平，尤其是mRNA水平较普通血小板高。利用噻唑橙荧光染料可以测定出循环中“网织”血小板的百分率。检测结果的诊断价值与患者血小板数目有关。当患者血小板计数＞50 000/ μl，“网织”血小板可作为一个指标判断血小板减少是由破坏过多还是生成减少引起的；当计数＜50 000/ μl，“网织”血小板绝对水平正常或下降就不能作为血小板生成减少的可信指标，因而临床应用受到一定限制^［9］。
 　　5.血小板储存与输注：用P-选择素(CD62)、CD63、GPⅡb/Ⅲa作分子标志物，发现血库中储存血小板有时间依赖性的活化现象^［16］。储存5天以上，40%～60%血小板表达活化标志CD62。虽然其形态改变、乳酸脱氢酶泄漏以及β-TG的释放也能反映其活化，但用CD62作为储存血小板的质量控制指标最理想。活化的血小板在循环中的存活时间很短。若血小板在储存时活化了，即使输注也不能很好地提高患者止血能力。
 　　6.抗血栓药物的监测：尽管使用了一些抗血小板药物，如阿斯匹林、潘生丁等，但抗血栓疗效不高，也不能明显降低病人的病死率。近年来文献报道了一些新的抗血栓药，如c7E3 Fab(嵌合单抗7E3的Fab片断)^［17］、合成多肽、Kistrin(一种蛇毒成分)^［18］等，能阻断GPⅡb/Ⅲa的功能，在抗血栓方面显示了良好的疗效。临床上已将c7E3 Fab用于冠状血管成形术中，避免术后再狭窄的发生。但是，这些新药价格昂贵，并有不同程度的毒副作用。活化血小板的检测可以判断患者是否需要抗血栓药物治疗，也可以监测这些抗血栓药物的作用^［8］，避免毒副反应的发生。

此外，全血法流式细胞术还可用于检测血小板聚集，研究其免疫表型HPA-Ⅰa，测定严重血小板减少患者的血小板数目。在尿毒症，心肺分流术（体外循环）中，本法也有临床诊断价值。

作者单位：510630 广州，暨南大学华侨医院检验科

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