复合技术具有成为实验室分析标准的可能性
Craig S. Hixson，Steven R. Binder
自身免疫性疾病是慢性病变或发炎症状所导致的异常免疫反应。不同的自身免疫性疾病以不同的方式影响人体。如，在多发性硬化症中自身免疫反应直接针对中枢神经系统，而肠道则被克罗恩病折磨。而且，相同疾病对个体组织和器官的影响并不相同。
应用于Bio-Rad实验室BioPlex2200免疫测定系统的磁性微粒扫描电子显微照片，此设备带有复合实验能力。
自身免疫性疾病的严重性取决于患病个体的免疫系统。此类疾病的发病率至少占人口的3%，对女性和老年人的影响不成比例1。发炎为此类疾病的常见症状，如头晕、疲劳、不适及低烧。器官性自身免疫性疾病对目标器官或组织具有破坏性，导致其功能受损2。
自身免疫性疾病很难诊断，尤其在发病初期。根据疾病情况，检测健康个体的特异性自身抗体说明阳性结果的范围为0-10%。大部分发现于健康人群的抗体滴定度较低，对其健康无关紧要。
自身抗体对单纯性风湿症情况并不一定具有特异性。如，抗双链DNA（dsDNA）抗体的反应通常与系统性红斑狼疮（SLE）相关。但是，在一些风湿性关节炎、干燥综合症、硬皮病、药物性狼疮、慢性活动性肝炎、突眼性甲状腺肿及其它情况下同时发现了抗-dsDNA抗体。抗-dsDNA抗体出现在具有这些症状的人群中，一般出现率小于5%。但是抗-dsDNA单独出现并不能诊断为SLE。
在一些病例中，自身抗体具有较强的疾病特异性。可鉴别一些常见风湿性疾病中的自身抗体目标（见表1）。
本文回顾了自身抗体检测技术，从已确定的方法开始，以考虑未来趋势结束。考虑的核心和焦点是蛋白质检测的复合技术。文章论述了自身免疫实验的多种复合技术，并描述了这些实验研究人员所面对的挑战。
目前的检测方法
第一个用于自身免疫相关抗体检测的方法以琼脂凝胶欧氏双重扩散法为基础，但其已被更为快捷、更为灵敏的半定量法代替。
血清自身抗体检测通常由实验室检测进行，如免疫测定（以酶类为基础）、间接免疫荧光显微技术（IFA）、免疫印迹法、免疫沉淀法。第一种方法为半定量法，其余为定性法。通过IFA进行筛查以实验室为中心，需要经过培训的技师通过显微镜进行目视判读从而获得染色图谱。此方法依赖观察者的技术，但缺乏可靠的标准。IFA方法阳性结果无法解释抗原。因此，界限值可建议具体的治疗方案。
这些方法存在较大的局限性，只能为每个分析提供单一结果。通常，需要多重检测才能报告出所需自身抗体结果的完整图谱。
检测分析物的同时，随着复合技术的到来，我们找到了长期寻找的目标——常规组合，如自身抗体、过敏原和甲状腺功能检测。实验中应用复合技术时，在同一反应槽中使用一次抽样样品可得出多个报告结果。复合技术是一种适用于诊断疾病的有效手段，是一种多因子技术，诊断需要大量的实验室检测。在分析模式下进行合理检测以确定多种分析物—复合技术—具有如下优势：
在试剂、实验室消耗品、尤其劳动力方面可节省开支；
可从少量患者标本中获得大量信息，对小儿科尤其重要；
具有同时检测多种分析物的能力，如核酸、抗原、抗体和药物；
内部质控可确保检测结果的准确性；
增加样本处理量；
具有确定分析物浓度的能力。
此外，复合技术符合目前的产业与市场趋势，如劳动力短缺、自动化重要性的提升、过程标准化、实验室整合。
芯片技术
蛋白质分析的复合技术是近期成熟的技术。此芯片技术包括两个主要的处理方式，一个是平面，另一个以磁珠为基础。
平面微阵列。此技术拥有一个二维微芯片。可确定单个实验的反应基因座。平面微阵列可将蛋白质、代谢物和其他分子的复杂混合物中的一些固定蛋白质检测与溶性相中的配合基绑定。多年前，一组研究人员建立自身抗原阵列，包括1152个反应表象3。平面阵列使用多聚赖氨酸镀膜玻璃显微镜载片作为固体支持器。在4或8个复制组上确定196个不同的假定自身抗原以生成有序阵列。蛋白质与固定培养基绑定，包括36个重组细胞或纯化蛋白质，6个核酸抗原，衍生于小细胞核核蛋白的154个重叠免疫优性合成肽，Smith抗原蛋白质，多（ADP-核糖）聚合酶，H1、H2A、H3、H4组蛋白2。阵列中包括抗体检测，针对磷酸活化重建蛋白质。由荧光物质Cy3标记的羊抗-人体IgG可作为阵列检测的常规标记。
在毫微克/毫升浓度中可检测到抗体，实验的线性范围超过Log3。分析灵敏度通常好于酶联免疫吸附测定（ELISA）类似物。点阵技术使Smith抗原和组蛋白灭活，这是验证研究中的技术问题。因此可推测，蛋白质与固体表面绑定使抗原决定基损失。研究人员指出此问题通过优化化学绑定或改进表面涂层可得到修正。此外，绑定在载玻片上的抗原受高蒸发率的影响。另一组研究人员进行的研究是使用质控物质和定标液在聚苯乙烯槽中确定14个复制的自身抗原（见图1）4。他们使用辣根过氧化物酶和活性化学发光培养基标记抗-人体IgG，通过以电耦合装置（CCD）相机为基础的芯片读卡器来记录光信号。使用人体IgG定标液可定量抗体。在简易微型化格局下此方法与常规有序临床检测相整合。使用塑型芯片获得的分析结果与通过商业检测试剂产品获得的结果相比较。
图1：用于研究的二维阵列设计原理图，其带有14个自身抗原（A-N），阳性（+）与阴性（-）质控，
在离散存储区域中IgG定标液浓度双倍增长，从1mg/ml（C1）至16mg/ml（C5）。
朗道Evidence产品是一种为临床实验室和生物医学研究所设计的自动化平台。其使用蛋白质生物芯片技术；检测以化学发光反应产生的光发射为基础，通过CCD相机检测。最近介绍了用于细胞介质检测设备的性能5。目前没有试剂可用于自身抗体检测。
磁珠微阵列。第二种蛋白质复合免疫测定技术使用微球悬浮液，每组微球可代表一个独立的分析实验。此系统有时被称为液态芯片。微球—塑胶珠尺寸为5µm—内部由荧光染料进行编码，其主要针对复合分析中的特殊检测。通过流式荧光光谱测定技术检测磁珠。应用微球悬浮液的自身免疫复合技术以Luminex公司（奥斯丁，得克萨斯州）研发的技术为基础。应用此公司的xMAP技术，荧光团编码微球可作为独立的分析条码6。每个磁珠组可被特定的生物检测特异性试剂包被，分析物通过磁珠组红色染料离散、近乎于红外线荧光染料的浓度来确定分析物。这可捕捉、检测出样本中的特异分析物（见图2）。在分析仪内部，激光可刺激磁珠的内部染料，可根据类型确定每种微球，实验中可捕捉到由第二种激光刺激的报告染料（通常为B-藻红蛋白）。每个磁珠组的读取方式为数十种至上百种。
图2：液相芯片系统中5X5红色/橙色-25个磁珠组阵列的标珠图。在此液相磁珠阵列图中，独立磁珠组具有不同红色和/或红外荧光染料，因此每组可由唯一的荧光信号辨识。
Luminex100流量仪应用数字信号，根据预定义存储区域对每种微球进行分类。每个微球的表面都带有多种羰基，可作为蛋白质共价附属物的位置。磁珠表面的定量报告取决于所使用的若干定标液。
微球的体积很小但表面积较大，比平面、固相阵列相比可进行较好的动力学反应。同时在这一点上，将悬浮液中微球的移动性与静态平面阵列的表面进行比较。将样本成功平均分配到平面阵列的区域中很关键，但在悬浮阵列中其并不重要。
应用液相芯片技术研究自身免疫的一些报告已公布。一项研究对同步检测5个萃取细胞核自身抗原进行观察，显示出基于一种检测的ELISA方法相关性良好7。另一小组研究37名干燥综合症女性血清中的抗核抗原（ANAs）和萃取细胞核抗原8。他们在血清中分别发现干燥综合症抗原A为84%、抗原B为76%（SSA和SSB）。
Bio-Rad实验室（Hercules，加利福尼亚）BioPlex2200抗核抗原筛查是基于液相芯片的全自动系统，可同步检测13个不同自身免疫抗体的水平。一项临床研究表明ANA筛查的特异性可与ELISA筛查ANA实验相比较9。如同ELISA方法，BioPlex系统比使用间接荧光免疫检测法进行自身抗体筛查的阳性率低。
优点与缺点。悬浮阵列和平面阵列的主要复合方法都具有优点和缺点。二维微片技术优于蛋白质或核酸的高密度筛查（超过100个检测）。在独立实验中，从细菌到人体，平面芯片适用于同步分析有机体中的整个基因组或蛋白质组。在此部分中，临床实验室可确定检测分析物，在狭窄面板中测定分析物，微球阵列在这方面具有明显优势。
有时微芯片缺乏高吞吐量临床应用设备所需的重复性10。这主要由于平面阵列准备过程所需的连续产品处理。相比之下，产生的大量微球可进行重复性检测，这是单个阵列无法提供的。
但平面阵列不能使用同一等级的冗余与统计研究，而微球阵列则能使用。这是因为在典型复合磁珠反应中，在阵列组中能够检测到数以百计的微球，它们代表独立的免疫测定，计算结果之前需排除数据组中的异常值。
悬浮阵列帮助每个磁珠组与配合基自定义相结合。与离散磁珠组绑定的配合基可与个体化绑定化学物质及其反应条件发生化学反应。如，与细胞裂解物或重组蛋白一样，每个配合基的纯度不尽相同。可使用磁珠组和其配合基之间的特殊链接。最终，可使用不同的标记图层或模块程序制造磁珠组。
在微球组中微珠阵列具有明显优势，在最优模式中分别制造，最后应用不同的磁珠组合并制成最终的复合磁珠试剂。
在微阵列实验中调节大量分析物，可使用内部质控确保预期实验系统的性能。在自身抗体复合检测中可使用多种质控物（见表2）。
表2：自身免疫抗体复合阵列包括内部质控各类磁珠。
磁珠类型 目的
内部标准液 使全部实验荧光信号标准化，以消除检测系统中的不稳定状态。
标本运送 监控标本类型的修正，监控容量减少造成的过失误差。
总IgG 在IgM实验中检测潜在干扰物中的全部IgG分子浓度。
类风湿因子 确认干扰某些实验的类风湿因子的存在。
相对荧光是微阵列方法的常规输出信号。可使用荧光内部标准（离散磁珠组或微型芯片）将实验信号标准化。标准化可补偿显色和检测系统中的波动。自身免疫检测的内部实验适用于临床标本的相应类型（如血清）和样本的相应容量11。此类内部质控是复合实验的特征。
可考虑在复合检测中使用其它内部质控物，其对一种分析物或系列分析物具有特异性。如，类风湿因子（RF）的内部实验可通过RF检测IgM自身抗体实验中的潜在干扰物。由于竞争性抑制，IgG高丙球蛋白血症标本并不干扰IgM分析，因此总IgG检测具有一定的有用性。
适当应用内部质控需要理解与分析物相关的技术问题，实验中应用的矩阵，合理的实验精密度和准确性，抑制其它未知的离散结果10。
挑战
如想被广泛接受，复合自身免疫实验必须克服大量技术障碍。以蛋白质为基础的微阵列比核酸类似物的发展更具挑战性。这是蛋白质在大小、电荷、形态、疏水性、类型、转译修正程度、四级结构上的异质性所导致的。当一些蛋白质与固相相结合时，其在维持特异性和活动性方面存在很大困难。
与全部免疫测定相同，自身抗体的同步检测需要明确的、可复制的、可扩展的抗原。这些包括为阵列构造而获取功能性蛋白表达，获得化学检测系统的分析灵敏度和较大的动力学范围。实验标准化、数据判读和存储会带来问题。每种分析物都需进行性能验证。而且，多种常见转译变异的存在使蛋白质组化学更为复杂。
重复性。分析方法中的复合技术成为实现良好重复性的障碍。通过重复性实验，通过试剂与检测过程的最优化实现精密度。应用平面阵列，重复两次或更多次检测每种分析物，对可接受变异和平均变异进行统计检测。应用磁珠悬浮阵列，针对每种分析物检测数百种单一磁珠或进行典型实验。需检测的磁珠数量与实验精密度间存在直接关系。
干扰。阵列中区域间的相互干扰是很严重的问题。信号干扰与平面阵列可相互干扰，但理论上微球阵列的问题更为棘手。在这些微球悬浮阵列中，实验反应中心不能被分割成离散的立体区域；投入使用前，液相中独立的磁珠组长期相互影响。
蛋白质与微球进行反应，主要通过共价键相结合，但彻底清洗后一些物质处于游离结合状态。非共价附着蛋白结合磁珠组可慢慢从固体表面脱离，可竞争性抑制液相反应物的反应；结果可能为假阴性。游离的物质可能向其他磁珠组移动，并附着于表面。这可能导致假阳性结果。
在产品有效期内，进行稳定性研究以确保配位附着蛋白质牢固的附着在其固相表面。在复合实验确认过程中，复合实验的结果必须与它们各自的单一结果相比较。理论上，稳定性研究应在有效期结束时进行，此时问题将尽可能的显现出来。全部分析物的复合实验与单一实验结果几乎相等时，研究人员才能得出混合磁珠组的结果无干扰（见图3）。
图3：对比相同单一实验和复合实验中一个面板上16种分析物的五个具有代表性实验的抗体指数。使用带有单一磁珠（蓝色）或16个磁珠（红色）组的复合阳性质控重复两次检测分析物。抗体指数等于标本的荧光读数除以定标液的荧光读数。
复合实验中交叉反应的数量是微球阵列实验数量中的一部分（见表3）。随着阵列复杂性提高，实验间的未知交叉反应会成倍增加。制造前，必须补救此类干扰。
表3：复合实验中潜在交叉反应的数量是阵列实验中的一部分。
复合实验 潜在的交叉反应
2 1
4 6
6 15
10 45
20 190
30 435
40 780
50 1225
灵敏度和特异性。应用自身抗体阵列达到临床灵敏度和特异性是一项巨大的挑战。因为自身免疫抗原特异性较差，在纯度、浓度和活动性方面主要反应物质并不相等，因此较难获得相等的结果。自身抗体实验通常在非平衡状态下进行。不同实验方法间的实验动力学和热力学的差异可导致不同的实验结果，尤其是抗体，其是浓缩中间体。
根据它们的本质，复合实验提供了过多的信息。自身抗体阵列的最重要特征是可产生自身抗体模式。借助于电脑软件分析复合实验的结果是最好的，可使用模式识别来进行差异疾病诊断。此类软件可加强诊断准确性、提高吞吐量和成本效益。此外，计算机程序可发现未被辨识的复合自身抗体模式。
有很多方法可以建立专业系统和解释法则。模式识别技术的引人之处在于其可以独立于任何假设、任何具有主观想法的人类专家，从而解释每个结果。模式识别不会要求为每个分析物命名或赋予其特色。
广谱方法
在一项研究调查中，自身抗体模式能够预测老鼠Ⅰ型糖尿病发展的抵抗力和敏感性，将一组266个不同抗原定位于玻璃芯片上。抗原包括源于热休克蛋白的缩氨酸；组织抗原；免疫系统成分；结构抗原；激素；酶类；血浆蛋白；合成低聚核苷酸；细菌抗原。从最初的266个抗原，综合27个抗原可提供将鼠抗糖尿病（环磷酰胺加速糖尿病，CAD）的化学加速模式分布图，其可与敏感模式相区别12。
根据自身抗体类型，研究人员发现鼠敏感CAD可与鼠抗相区别，甚至可发生在加速化学实验之前。与晚期CAD糖尿病鼠相比，研究人员也发现了健康者自身抗体特征模式；此种模式与发现的早期CAD抗原组不同。一旦出现糖尿病症状，IgG对一些抗原的反应性可预测CAD的未来敏感性，但CAD自身不能。另一方面，一些IgG的反应性可预示疾病，而不是敏感性。因此，未来疾病的预测、目前的疾病诊断都可依赖不同滴定模式的自身抗体。
此研究说明广谱方法可界定不同风湿性疾病中自身抗体的特征。未来，会发现新型抗体模式，可预测自身免疫性疾病的发展阶段，或提示首选的治疗程序。
未来应用
自身抗体阵列的复合实验预示未来重要的研究方向和临床应用。最为明显的是筛查大量抗原可潜在的反映出特异性自身免疫性疾病，以辅助诊断和治疗。未来，评估潜在致病性而检测包括人IgG在内的同型抗原，检测自身免疫反应表位扩展的特征，确定特异抗原模式界定治疗方法的过程说明，这些都将成为可行性应用。在尚未被认识的自身免疫性疾病或其亚类中，三种复合实验非常有效。
这些方法还可应用于医学其他领域，包括过敏原、治疗药物、滥用药物、血清学抗体、心脏疾病和癌症蛋白标志物的分析。
高数值微阵列—超过100个分析物—在研究环境下用途最大。成百上千的复合实验令研究人员能够识别特定疾病临床不相关物质中的自身免疫生物标志有限集群。探索阶段后，有限密度阵列中的蛋白质可应用于临床，但这些分析物少于100种。
结论
可使用一台电脑控制免疫测定开放系统分析仪，进行自身抗体和其他分析物的全自动复合实验，可为标本与试剂面板提供随机和连续存取，将实验室信息系统、初始试管取样、统计能力完全整合。精密产品的技术、经济效益和工作流程优势突出，以此新技术为基础的设备将为传统的ELISA、免疫印迹及IFA技术提供解决方法。
参考文献
1、AA Ismail and N Snowden, “Autoantibodies and Specific Serum Proteins in the Diagnosis of Rheumatological Diseases,” Annals of Clinical Biochemistry 36 (1999): 565-578.
2、HO Ogedegbe, “Autoimmune Diseases: A Spectrum of Disease Processes,” Laboratory Medicine 32 (2001): 670-679.
3、WH Robinson et al., “Autoantigen Microarrays for Multiplex Characterization of Autoantibody Responses,” Nature Medicine 8 (2002): 295-301.
4、Y Feng et al., “Parallel Detection of Autoantibodies with Microarrays in Rheumatoid Diseases,” Clinical Chemistry 50 (2004): 416-422.
5、SP Fitzgerald et al., “Development of a High-Throughput Automated Analyzer Using Biochip Array Technology,” Clinical Chemistry 51, no. 7 (2005): 1165-1176.
6、RJ Fulton et al., “Advanced Multiplexed Analysis with the FlowMetrix System,” Clinical Chemistry 43 (1997): 1749-1756.
7、TB Martins et al., “Evaluation of Multiplexed Fluorescent Microsphere Immunoassay for Detection of Autoantibodies to Nuclear Antigens,” Clinical & Diagnostic Laboratory Immunology 11 (2004): 1054-1059.
8、B Gilburd et al., “Autoantibodies Profile in the Sera of Patients with Sj-gren’s Syndrome: The ANA Evaluation—a Homogeneous, Multiplexed System,” Clinical and Developmental Immunology 11 (2004): 53-56.
9、O Shovman et al., “Evaluation of the BioPlex 2200 ANA Screen. Analysis of 510 Healthy Subjects: Incidence of Natural/Predictive Autoantibodies,” Annals of the New York Academy of Sciences 1050 (2005): 380-388.
10、L Shi et al., “QA/QC: Challenges and Pitfalls Facing the Microarray Community and Regulatory Agencies,” Expert Review of Molecular Diagnostics 4 (2004): 761-777.
11、TB Martins, “Development of Internal Controls for the Luminex Instrument as Part of a Multiplex Seven-Analyte Viral Respiratory Antibody Profile,” Clinical & Diagnostic Laboratory Immunology 9 (2002): 41-45.
12、FJ Quintana et al., “Functional Immunomics: Microarray Analysis of IgG Autoantibody Repertoires Predicts the Future Response of Mice to Induced Diabetes,” Proceedings of the National Academy of Sciences 101, supp. 2 (2004): 14615-14621.
