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荧光定量PCR仪器大观


[ 来源:本站 | 作者:本站编辑 | 时间:2008-01-13 01:03:24 | 浏览: ]

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      荧光定量PCR技术已成为临床分子检测的重要手段之一,其以敏感性、特异性而被越来越多的科研人员所看好,荧光定量PCR仪的性能与检测结果的准确性密切相关。自美国应用生物系统公司自1996年推出第一台市场化的荧光定量PCR仪以来, 现在国内很多厂家都在生产此类仪器,但高端产品基本还被ABI、 Roche、 Bio-Rad等公司所垄断,现在就将几个主要厂家的仪器介绍给广大读者,随着国内对PCR诊断的再认识,相信荧光定量PCR技术会很快走进临床检验阶段。

按照仪器的加热性能可以将它们划归为2类:
    一类是半导体(半导体+电热丝)加热。硅加热是使用最普遍的一种,导热好,易自动化,速度快,直接加热降温,效果好,但由于其使用的介质是金属,与反应管很难做到无缝接触。ABI、Bio—Rad等都属于这一种。主要代表机型包括:
                          

美国应用生物公司的实时荧光定量PCR Prism7500

    ABI(美国应用生物)公司于1996年推出荧光定量PCR技术,ABI(美国应用生物)公司主要销售Prism7000、7300、7500、7900HT 4种实时荧光定量PCR仪。其中,Prism7000为四色荧光,只能用于2种染料,TaqMan和SYBRGreen I,现在已经停产; Prisr 7300为四色荧光,能够有效地分辨包括FAM™SYBRGreen I、VICnq/J0E 、TAMRA™和ROX™在内的多种荧光染料,是7000的升级机型;Prism7500应该是ABI公司最成功的产品,各方面性能都不错。

    7500型实时荧光定量PCR系统的全部96个样品孔采用同一卤钨灯作为光源,卤钨灯光通过五色光源滤光片后激发每一个分析样品。卤钨灯光源增加光源滤光片后改善了长波长红色荧光标记的激发效果,可以大大提高红色荧光检测的灵敏度和定量分析的准确性。激发后的荧光再通过五色荧光滤光片到达CCD照相机检测信号。五色荧光滤光片能够有效地分辨包括:FAM™/SYBR Green I, VIC/JOE, NED™/TAMRA™/ Cy3, ROX™/Texas Red和Cy5在内的多种荧光染料。光源易更换,但是寿命相对较短。

    7500型实时荧光定量PCR系统的标准模式采用25-100微升反应体积,可以采用96孔板或单管/8联管进行实验反应。另外7500还可以升级为快速热循环样品基座,该升级为选购件,由ABI公司工程师负责安装。快速热循环样品基座采用新型96孔反应板,这种反应板的管内液体上方的空间较小,可以支持5-30微升反应体积的实验。采用样品基座升级后的7500,新型96孔反应板和新型快速热循环定量PCR预混试剂,实时定量PCR实验可以在40分钟内完成,实验效果与标准2小时模式完全一致。

    在使用TaqMan的RNA合成酶P仪器安装板的情况下,7500型实时荧光定量PCR系统能够区分5,000和10,000模板拷贝数,可以检测50ul反应体积单一报告荧光TaqMan实验中仅10个起始拷贝数的模板,其置信度高达99.7%,可达  9个数量级的线性范围。

    高效平台-7900HT系统是为支持高通量而构建的,光学系统经优化以适用于384~L板荧光信号的激活和实时检测。7300、7500、7900均可进行基因表达分析,病原体绝对定量分析,SNP基因型分析以及以阳性内对照为基础的阳性/阴性结果判定。但是所有定量实验都依赖于染料ROX,用于校正。

    ABI的7300、7500、7900均可进行基因表达分析,病原体绝对定量分析,SNP基因型分析以及以阳性内对照为基础的阳性/阴性结果判定。但是所有定量实验都依赖于染料ROX,用于校正。
                 
  
美国Bio—Rad公司实时荧光定量PCR  iCycler

    Bio—Rad公司的iCycler PCR相对于其他仪器还是非常有特色的,主要体现如下:
具有梯度PCR功能,独特的96孔板温度梯度控制,一次性摸索8个不同的温度条件,可用于快速优化实验条件,这一点世其他实时荧光PCR仪器所没有的,是iCycler和MJ系列仪器所特有的一项功能。特具动态温控功能,保证梯度反应的准确性和均一性外,还可使每个反应孔以不同的变温速率下降或上升,保证每个反应孔在进行梯度反应时的实际加热时间绝对一致。许多同类仪器,温度准确性随着温度的增加而降低;iCycler PCR 仪按照NIST 可溯源的过程生产,保证在全部的温度范围,温度准确性在+0.3C。同样,样品模块的温度均一性在较高温度下也很难保持,然而iCycler在全部的温度范围,保证温度均一性在+0.4C;循环速度对于多用户和高通量的应用来说,也是苛刻的条件,iCycler PCR 仪的升降温速度可以达到至少3.3C/秒,并可以通过模块、样品内探头以及算法控制温度;免费的固件升级可以实现温度梯度功能;温度梯度功能能够最大限度方便试剂和温度的优化;显示温度的准确性保证标准检测的平稳变换。3、专利技术intersifier荧光放大器保证了极高的检测灵敏度。4、可对加样误差进行校正,不依赖于ROX校正。

Bio-Rad iCycler PCR仪主要技术: 

内存容量 最多可存255个反应程序文件   
操作系统  Window   
大小 (宽x 长 x 高) 26 x 55 x 23 cm   
重量 11.8 Kg (26lb)   
平均运转时间 1-2小时   
检测硬件 CCD镜头, 多波长   
检测光路 96同一光路同时检测   
光源 卤素灯   
动力学范围 9X   
支付的化学方式  TAQMAN 探针可作定量,作熔点曲线分析,SYBRGEEN I 分子信标,又FRET探针,MGB 探针    定量方法 外对照内对照    
加热模式 固体块,半导体加热,3.3℃/秒   
反应体系 96x0.2ml PCR反应管 
                   

美国Stratagene实时荧光定量PCR仪Mx3000P
   
    美国Stratagene公司2003年开发出实时荧光定量PCR仪Mx3000P,通过Mx3000P,Stratagene将定量PCR仪带入了个人化的时代。该仪器具有精确的温度控制系统、宽广的光学检测系统、操作简便而功能强大的软件。
优良的硬件性能:
·精确的温度控制:孔间差不超过0.25€C。
·快速的升降温速度:2.5C/s,有效缩短实验时间。
·广泛的荧光选择:四通道滤光片组,可同时检测4种荧光信号,支持常用的所有荧光染料。
·扫描式检测,避免了各样品间的光程差,无需内参校正。
·主流的高通量实验平台:可同时进行96个反应。
·内置芯片实时保存实验数据,防止因突然断电或连接中断而丢失数据。
·开放的平台,试剂和耗材可自由选择。
强大的软件功能:
·界面友好,操作灵活,使用方便。
·实验条件设置、反应过程监控、数据显示分析三大功能模块从同一界面链接,直观简便。
·反应过程中不但实时监测荧光信号,还能实时分析数据。
·全面的分析模式,可进行(多重)绝对定量PCR、相对定量PCR、SYBR Green I定量及熔解曲线分析、SNP分析、Molecular Beacon熔解曲线分析等。
·提供多种数据显示模式,用户可根据自己需要选择:扩增曲线模式、熔解曲线模式、标准曲线模式、原始荧光信号模式、最终定量结果模式等。
·所有结果可以原始数据的形式显示,也可输出到Excel中作进一步分析,曲线和表格等结果可直接用于PowerPoint、Text等文档中。

系统参数
 
激发光源 石英卤钨灯,激发波长350-750nm   
检测系统 光电倍增管(PMT), 检测波长350-700nm   
可应用技术方法 Taqman, Molecular Beacons, SYBR Green I, Scorpions, Amplifluor等   
可用荧光染料 FAM, SYBR Green I, HEX, JOE, VIC, ROX, TEXAS RED, Cy3, Cy5, TET, Alexa 350, TAMRA    多色检测 四通道,可同时检测4色荧光   
滤光片组标准配置 FAM/SYBR Green I,HEX/JOE/VIC,ROX/TEXAS RED,Cy5   
样品容量 96孔板,8联管或单管   
温控方式 Peltier热循环器   
升温速度 2.5℃/s   
降温速度 2.5℃/s   
温度均一性 ±0.25℃   
温度精确性 ±0.25℃   
线性范围 10个数量级   
检测分辨度 区别5000个拷贝与10000个拷贝样品的可信度为99.7%   
常规检测速率 40个循环<1.5h,  96孔扫描一遍3.5s   
快速反应 与FullVelocity Kit配套使用,40个循环小于60min   
尺寸 46cm(深) X 33cm(宽) X 43cm(高)   
重量 19公斤  
                        
   
美国Cepheid公司的实时荧光定量PCR仪Smart Cycler

    成立于1996年的美国Cepheid公司是一个致力于开发、生产用于生命科学研究和传染性疾病诊断仪器的厂家。它由世界顶级科学家及经济学家组成的团队领导,自成立以来,在美国防御发展计划组,U.S.军队传染病医学研究中心,U.S.军队士兵和生物化学合作所的资金项目支持下,合作开发出能快速,准确检测传染性病原体,人类基因及工业和环境污染的DNA分析系统。

    与美国安全局多年合作的Cepheid公司开发的Smart Cycler扩增仪,是一个以快速,通用,高效闻名的实时荧光定量PCR系统。1998年基于LINL技术的Smart cycler就赢得了美国R&D Top 100称号,LINL技术使得研究人员在30分钟之内即可完成定量DNA分析。

    Cycler最初被开发是为生物战场上提供一个便携式检测致病原的仪器。由于其小巧的外形,快速的检测时间(1个小时内即可检测出病原体),拥有16个独立程序I-CORETM(智能升/降温反应)模块的板块,成为世界上唯一允许不同条件的PCR反应同时进行的定量PCR仪器,即同一或不同操作者在同一板块上可进行不同程序的PCR反应, 也就是说这16个样品槽相当于16台独立的定量pcr仪!独立控温的好处首先是,你可以在同一定量pcr仪上分别进行不同条件的定量pcr反应,更为灵活自定义的梯度优化反应也好,或者是完全不同的几组反应——甚至,你可能只进行个别样品的检测,只占用其中几个样品槽——过一会儿其它的同事也要用——他不需要等待你的反应结束,而可以随时利用空置的样品槽开始其它定量反应!对于各有各忙的多成员的实验室,要是个别样品就占据96孔样品槽,其它人每轮要再等2个多小时,有时还要等几轮,那可够郁闷的。Smart 20cycler 20ii的使用频率可以被最大化,大家都不用等待!这个世界上唯一允许不同条件pcr同时进行的定量pcr仪拥有独一无二的优点,是其它任何平板式或者离心式定量pcr都不具备的。

    此外,每个温控模块只控制一个样品槽,升降温速度当然更快——高达10℃/秒,控温精度自然就更高——这里根本不用考虑不同样品槽之间的温度均一性的问题,只有每个模块控温精确度的问题。对于普通的96孔板固定加热模块,本身有控温精度和准确度的差异,再加上样品槽不同位置之间的温度差异,而Smart CyclerII就完全减少了一个误差因素。优异的特性使得只要20分钟就可以完成常规的定量PCR反应,大大提高研究人员的工作效率。每个模块独立控制的激发光源和检测器直接与反应管壁接触,保证荧光激发和检测不受外界干扰,固定的结构使得仪器运行更稳定,使用寿命更长。整合有4通道光学检测系统,分别可以检测FAM/SYBR Green I, Tet/ Cy3, Texas Red和Cy5,可在同一样本中进行多靶点分析,同时检测4种荧光信号,可使用多种检测方法,包括Taqman探针、分子信标、Amplifluor引物和Scorpion引物和荧光内插染料等等。宽达9个数量级的线性范围。

    该系统的一台电脑可以同时连接6个板块,灵活性强,极大满足了实验室对检测量的需求,同时也降低了成本。故现今该系统已被广泛应用于传染性疾病及基因检测。在国内,主要是在疾病预防控制中心和一些科研实验室中应用。

    二类是空气加热。用空气做介质有优点,与反应体系无缝接触,空气的导热性相对较差、比热小,所以此类仪器加样量一般都很小。

                       

                                     Roche公司的LightCycler480

    自1998年率先推出基于毛细管反应的LightCycler系列以来,罗氏应用科学部就在反应速度和准确性,操作的实用性和使用的灵活性方面不断地尝试突破,2005年7月又推出了基于微孔板的LightCycler480高通量实时定量PCR系统, 满足科研工作者对于定量PCR系统高通量方面的要求,以及将实时PCR系统整合到整个自动化工作流程中的需要。独特的离心、空气加热、毛细管等设计,使其成为很有特色的PCR仪。主要特点包括:
    1、温度均一:LightCycler 480采用革新的ThermaBase™ 技术保证了加热的均一性,结合独特的散热鳍和高性能风扇保证散热的快速,确保了均一的孔间温度,实现了完美的定量准确性和重复性。
    2、反应速度快:LightCycler 480秉承了LightCycler系列一贯的反应速度快的特质,在确保准确性的前提下,大大提升了传统平板式定量PCR仪器的反应速度,384个样品完成40个循环的时间少于40分钟。
    3、无需任何的内参和标准化的平板:集优秀设计于一体的LightCycler 480,无需在反应体系中加入任何的内参,保证了最原始真实的分析数据来源。
    4、反应模块自主更新:根据研究的需要,用户可以在几分钟的时间里完成96或384反应模块的更换,而不需要任何的繁琐的校正过程,轻松实现中高通量的自主选择。
    5、多检测通道支持所有的检测模式:LightCycler 480系统支持目前所有检测模式的使用,包括 杂交探针、SYBR Green I DNA结合染色、 单探针、水解探针和分子信标等等。多色荧光检测系统,提供五色激发通道(450 nm, 483 nm, 523 nm, 558 nm, 615 nm)和六色荧光检测通道( 500 nm, 533 nm, 568 nm, 610 nm, 640 nm, 670 nm),并具有颜色补偿功能;可自由选择,轻松实现多重或多色PCR。
    6、操作界面友好:LightCycler 480系统软件界面是专门为高通量的样品操作设计的,操作简便,还有独特的“step-saving”功能,方便大量样品的编辑和数据处理。
    7、模块系统概念:LightCycler 480在系统初始配置的基础上,还可根据客户的特别要求,通过在系统中添加各种先进的软件分析模块进行系统升级,满足用户不同阶段的研究需求。目前可提供的系统模块包括了:定性检测,绝对定量分析,相对定量分析,统计分析工具,基因分型研究
    8、锦上添花的系统试剂和耗材:经系统优化的LightCycler 480配套选择试剂,普遍采用了Hotstar的热启动技术,确保快速循环体系中反应灵敏度和特异性的最大化;其室温条件下的超长稳定性,也为大量样本的操作提供最宽泛的条件。特殊工程设计的微孔板可以保证与加热模块的完美的“亲密接触”,确保PCR的高灵敏度和可重复性;高品质的材质,提供了出色的信噪比和光学敏感度;自带的条形码更加方便流程操作的需要。
    9、良好的兼容性:LightCycler 480可顺利实现与现有实验室系统联结,包括LIMS或是与自动装载微孔板的工作站联用实现全流程的自动化操作。
    10、符合FDA的标准:所有的数据采集和结果分析符合FDA的21 CFR Part II 标准,让你的数据得到最全面的保护。

    Roche的LightCycler系列以运行速度快而著称,在国内市场占有率最高,其设计保证了临床诊断的准确性,又充分考虑了科研功能。

    实际操作中应注意如下问题:因为毛细管很细,所以反应液在毛细管中的对流交换容易不畅,没有充分混匀时就加入毛细管会影响反应的进行,当然,热启动酶就不会有这方面的问题。所以在操作时要将反应液混合充分后再加入毛细管,这样就可以保证实验中不会出现问题。


Corbett 公司的Rotor-Gene 3000荧光实时定量PCR仪

    Corbett 公司Rotor-Gene系列有2000、3000和6000等型号,分别于2000年、2003年和2006年推出。2006年11月27日—Frost & Sullivan 公司授予Corbett Life  Science公司2006年度实时定量PCR领域技术创新奖,表彰其在实时定量PCR领域作出的创新性的贡献。Corbett公司以离心式为基础的定量PCR仪,采用了与众不同的方法,解决了传统定量PCR仪所无法解决的问题。离心式的设计使其具有更卓越的温度和光学均一性,这也是其热循环仪的立足基础之所在。这种设计使其定量PCR仪能够提供更准确的分析,这对于实时定量分析是至关重要的,并且它为例如HRM(high  resolution melt)这一类激动人心的全新应用开启了一扇大门。率先将HRM高分辨率熔解与定量扩增相整合,真正实现了HRM的闭管自动化分析。

    Corbett的Rotor-Gene6000标准型是真正独立的6通道,6个独立LED激发光源470nm/530nm/585nm/625nm/670 nm/460 nm),它的每个通道都配有独立的激发和检测通路,覆盖紫外到红外光谱。这拓展了可应用于研究的染料范围,同时扩大了可进行实时监测的mRNA的信息的数目,保证最少的光谱交叉(<1%)。PMT检测,6个检测滤光片,可检测荧光包括FAM/SYBR Green I、TET、VIC/JOE、HEX、Max、NED/TAMRA/Cy3、ROX/Texas Red和Cy5,Cy5.5等,机器的适用性非常宽,开放的试剂系统使得机器可适用Taqman探针、荧光染料SYBR Green I检测、分子信标、FRET探针等。Rotor-Gene6000灵敏度高,宽达12个数量级的线性范围,可正确区分1、2、3个拷贝的基因,重复性极佳(R>0.99935)。由于转子在反应过程之中一直以恒定的低速400转/分钟旋转,使得样品间的温度均一性(为0.01℃)极佳,同一热反应室提供完全相同的反应条件,同一光学通路提供完全相同的测量通道,每标本每升温一度检测1000次,满足高精度和一致性要求。Rotor-Gene6000提供了36x0.2ml、72x0.1ml 和100X30l3种转子,检测是通过薄壁管侧壁而非管底进行的,因而可以使用普通的0.2ml PCR管,并允许在试管盖上标记,这降低了使用成本。Rotor—Gene6000优于多数的固定加热模块的机型,管内实际升温速度达到10℃/s。Corbett还有一个光学变性专利——让待扩增样品预先进行一次熔解曲线程序,检测荧光染料信号大小的变化,找到代表全部双链DNA解链的峰值对应温度,在其后的反应中就无需总是将变性温度设为94,也不需要延长孵育时间。这个专利使得反应过程大大缩短。

    Rotor—Gene6000的光源永久不用更换,而且无需ROX校正。

来源:本站    



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原始作者: 本站编辑 录入时间: 2008-01-13 01:03:24
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