第六章 临床生化诊断试剂盒的选择与评价
随着自动生化分析仪的研制成功和普遍使用，推动了体外诊断试剂商品化的进程，商品试剂与标准液按检测项目组合成一套放在一个包装盒内叫试剂盒（reagen kit），或叫试剂组合（reagen set）。与自动化分析仪匹配的试剂盒的研制、生产和供应走向产业化的道路，它无疑是临床生化发展史上一个巨大的技术进步。但是，试剂盒的质量，将严重影响测定结果的正确性。为了增强识别试剂质量的能力，提高拒用劣质试剂的自觉性，掌握有关试剂盒的质量标准和质量评价是十分有益的。
第一节试剂盒的分类和特点
临床生化诊断试剂种类繁多，有液体型、粉剂型、片剂型，有单一试剂、双试剂、干试剂、多试剂等。生产厂、供应商也很多。纵观近20多年来的发展，临床生化体外诊断试剂盒的分类和发展历史可用下图6-1 表示。
一、液体型试剂和粉（片）剂型试剂
（一）液体型试剂
无论是单试剂还是双试剂型试剂，目前乃至今后仍以液体型为主要剂型。其优点是液体型试剂的试剂组分高度均一，瓶间差异小，测定重复性好和使用方便；它也无需加入任何辅助试剂及蒸馏水，避免了外源性水质对试剂的影响，性能较稳定，测定结果较为准确。缺点是液体型试剂（尤其是酶试剂）保存时间较短，不便于运输。
1．液体单试剂 所谓液体单试剂就是将某种生化检验项目所用到的试剂科学地混合在一起，组成为一种试剂。应用时，只须将标本和试剂按一定比例混合，即可进行相应的生化反应，然后用适当的方法检测结果。应用十分方便。为了简化测定操作程序，提高工作效率，一度大多数试剂厂家都生产单试剂，以满足用户的需要。如测定葡萄糖和胆固醇的酶法试剂等。这些试剂的广泛使用，充分显示出酶法试剂无毒性、操作简便快速、测定结果可靠等优点。但对有些生化检验项目来说，单试剂存在抗干扰能力差的缺点，给测定结果带来相当大的分析误差。例如，甘油三酯测定的一步法试剂，由于未消除样品中的游离甘油，使测定结果中包括了内源性甘油（平均约为0.11mmol/L），会给甘油三酯的测定值带来较大的误差。类似的情况还见于维生素C和尿酸及胆红素对Trinder反应的干扰，内外源性NH4+对尿素酶法测定的干扰，以及内源性丙酮酸对ALT、AST测定的干扰等。选用时值得注意。
2．液体双试剂 所谓液体双试剂就是将某些生化检测项目所用到的试剂，按用途科学地分成两类，分别配成两种试剂，通常第一试剂加入后可起到全部或部分消除某些内源性干扰的作用，第二试剂为启动被检测物质反应的试剂，两种试剂混合后才共同完成被检项目的生化反应。然后用适当的方法检测结果。双试剂型试剂盒，它保持了单试剂的优点，增强了抗干扰能力和试剂的稳定性，提高了测定的准确性，代表了诊断试剂盒剂型研制的主要发展方向。
（二）粉（片）剂型试剂
所谓粉剂型及片剂型试剂，即是将试剂的各组分用球磨技术粉碎成粉剂或混合后压成片剂，使用前再加入指定的溶液复溶成液体试剂。干粉试剂如果在冻干分装前是液体型的，则其各组分是相当均匀的；但如果用固体原料研磨后制成粉剂或片剂，则存在许多问题：①要使试剂各组分混合得非常均匀，技术难度很大；②分装过程中的称量误差及复溶时加水量的准确性影响试剂的瓶间差；③水质优劣对试剂的稳定性和测定的可靠性有相当大的影响。
二、其它类型试剂
为了适应生化分析仪和测定方法学的进步，近年来研究了许多新型的试剂盒，主要有以下几种。
（一）快速反应试剂盒
快速反应试剂盒主要是为了适应生化分析的技术进步，缩短反应时间，提高工作效率。如血液葡萄糖快速测定试剂盒。其试剂成分及浓度为磷酸盐缓冲液100mmol/ L，pH7.4±0.1，葡萄糖氧化酶 > 40u / ml，变旋酶 > 0.2u / ml，过氧化物酶 > 2.5u / ml，4-氨基安替比林0.5 mmol/ L，4-羟基苯甲酸4 mmol/L，亚铁氰化钾1mg / L，叠氮钠
（二）一步法试剂盒
这是随着方法学的改进，特别是免疫技术的进步，利用特异性抗体参与反应的新型试剂。如高密度脂蛋白（HDL）测定。以往多采用超速离心法和沉淀法使HDL从其他脂蛋白中分离后再测定HDL中胆固醇，沉淀法操作繁琐，必须预先处理才能用生化分析仪分析。近年来采用抗低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白血清预先抑制LDL及VLDL，然后再测定HDL，这样就减少沉淀预处理，直接测定出高密度胆固醇。类似的试剂盒还有肌酸激酶（CK）及其同工酶CK-MB的测定。
（三）多项同测组合试剂盒
这类型试剂主要是用于三点双项同测终点法、三点双项同测连续监测法和三点双项同测终点速率法测定的试剂盒。很明显这类试剂同以往单试剂和双试剂有明显不同。随着双试剂的应用，临床生化分析仪的分析方法也相应发展，其中有一种分析方法是在同一比色杯中，先后加入两种试剂与检品中的两种被检物发生反应，在各反应达到平衡期时分别测定，整个测定过程进行三次比色，测定两个项目，称为三点双项同测终点法。例如甘油三脂、胆固醇同时测定法。该法的第一试剂为Tris缓冲液，含胆固醇酯酶、ATP、MgCl2、过氧化物酶、磷酸甘油氧化酶、甘油激酶、脂肪酶、4-氨基安替吡啉、2-羟3.5-氯苯磺酸钠、Triton-X等，第二试剂为Tris缓冲液，其中含胆固醇氧化酶。当血清或标准液（包括甘油三酯和胆固醇）与第一试剂混合后立即进行第一次比色（510nm）得空白吸光度。
甘油三酯浓度=[A2（样品）-AB（样品）]/[A2（TG标准）-AB（TG标准）]×甘油三酯标准的浓度
总胆固醇浓度=[A3（样品）-A2（样品）]/[A3（TC标准）-A2（TC标准）]×胆固醇标准的浓度
（四）卡式试剂盒
试剂首先装入试剂瓶，瓶上充分使用编码技术，而后根据编码启动调配、使用及更换储存。其特点是：①卡式试剂瓶上条码令使用者可快捷准确地输入试剂数据，如测试数量、批号、有效期，保证正确识别试剂。②试剂装载后能自动调配，可消除潜在误差，并节省操作时间。③持续不断地监察仪器上已装载的试剂存量，并在供应量不足时通知使用者。试剂装载使用时间可长达一个月。④所有卡式试剂盒大小划一，有利储存。卡式试剂设计较独特，可防止试剂蒸发及降解，能确保试剂装载后的稳定性更长，从而节省成本。⑤标签根据测试类别以颜色编码，便于使用者识别。
（五）浓缩试剂盒
上述卡式试剂盒就是采用的浓缩试剂，使用时自动完成稀释，而后用于测定。浓缩试剂便于工作、储存、运输、装载等优越性是很明显的，浓缩试剂便于监控、减少校正次数、提高工作质量。在浓缩试剂基础上又组成双试剂及多项同测组合试剂，又体现出它们所具有的特点及优越性。以后这种浓缩试剂及其各种组合，将成为一种时尚，将成为人们乐于使用的新型试剂盒。
三、液体双试剂盒的特点
液体双试剂与其它类型试剂比较具有液体试剂和双试剂的优点。
（一）提高了抗干扰反应的能力
在临床生化测定过程中，血标本除了含有待测物质外，还含有各种酶、有机物、无机盐等物质，这些物质都会干扰或参与测试反应，引起非特异性反应干扰，而双试剂型试剂盒设计的一个主要目的就是为了克服这种干扰反应。在测定过程中，首先让试剂Ⅰ与标本中的干扰物质反应，反应5分钟后，再用试剂Ⅱ启动真正的测试反应，从而使测定结果更加准确。
例如：尿素氮的酶法测定。此测定通过二步化学反应来完成。
在340nm下监测吸光度值的变化，与同样处理的尿素标准液比较，计算出样品尿素含量。这一反应的第一步特异性高，脲酶只对样品中的尿素起催化作用，但第二步反应就存在一些干扰：样品中（如血清、尿液）含有NH4，（内源性NH4）会消耗NADH，使测定结果偏高；复溶试剂时所用蒸馏水如果含有NH4或者所用器材不够清洁被NH4污染（外源性NH4）也会消耗NADH，使测定结果偏高；当样品中（如血清）含有较高的丙酮酸时，血清中的乳酸脱氢酶会催化下列反应：
也会消耗NADH，使测定结果偏高。也就是说，用单一试剂型试剂测定尿素时存在内源性NH4、外源性NH4和内源性丙酮酸的干扰，使测定结果产生正误差。
测定尿素的酶法双试剂（液体型）试剂盒有两个试剂，均为液体，不必复溶。第一试剂含α-酮戊二酸、NADH、谷氨酸脱氢酶及维持pH的缓冲物质。第二试剂含脲酶、NADH、α-酮戊二酸。当被检样品加入第一试剂在
再如：目前在临床化学检测中用的较为普遍的指示反应Trinder反应（主要用于代谢产物的测定，如葡萄糖、尿酸、甘油三脂、胆固醇、HDL），此指示反应的特异性较差，受到血标本中的胆红素、抗坏血酸的干扰，导致结果的阴性偏差。其中为了克服胆红素的干扰，国内外部分试剂已通过加入铁氰化钾、调整显色剂改变测定波长来排除胆红素的干扰，而抗坏血酸的影响和干扰一直较难克服，从面影响了测定结果。液体双试剂（包括甘油三脂、胆固醇、HDL、尿酸、肌酐）在试剂I中加入了抗坏血酸氧化酶，当标本和试剂I先反应，便可克服标本抗坏血酸的干扰，当抗干扰反应完毕后，再加入试剂Ⅱ启动反应，从而使得整个反应的特异性大大提高，准确度也相应提高。
另外，最常见的干扰是黄疸。有的测定试剂中加有胆红素氧化酶，先作用黄疸血清使其氧化无色，而后再加反应试剂完成反应测定，消除黄疸的影响。
（二）使测定更科学合理
由于液体双试剂的使用，使测定更加科学合理。如
目前国内临床生化检验使用的生化试剂绝大多数都是单一试剂，在甘油三脂测定中测得甘油三脂的含量实际上是标本中甘油三脂与游离甘油的总含量，尽管临床上可以通过减去标本中平均游离甘油的含量和修改正常范围加以弥补，但是，由于临床标本的个体差异，使得血标本中游离甘油的含量不可能都一样。而液体双试剂可先让标本与试剂I反应（试剂I中包括甘油激酶、抗坏血酸氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶、过氧化物酶），从而彻底消耗标本中游离甘油，排除抗坏血酸的干扰，然后再用试剂Ⅱ含有LP和发色团启动反应，使得测得的结果真正反映标本中甘油三脂的含量。
（三）稳定性能优良
目前临床化学检定的许多项目都已用酶法进行测定，这些酶法测定与以往化学测定法相比具有无可比拟的优越性：①特异性高；②试剂单一，操作步骤简单，可自动操作；③反应温和，无污染等。但是酶法生化商品试剂生产的最大技术障碍便是试剂的稳定性问题，为此许多试剂生产厂家推出了冻干、干粉、片剂的酶法试剂，从而解决了成品贮存与运输问题，然而在使用过程中仍然受到了复溶后稳定性的影响，各实验室在使用中如果包装太大，复溶后稳定期过后便会造成浪费，如果包装太小，本身价格太高，造成日常化验成本居高不下。全液体酶法试剂从分配上解决了这一矛盾：①用户可根据每次标本量多少按一定比例配制适量工作液，当天配制当天用完，这样便可减少试剂损失。②如果用户使用的自动生化分析仪有双试剂测定功能，那么，就不必把双试剂混合成工作试剂进行测定，试剂的有效期一年便是工作液的有效期。
对于干粉、片剂型等需复溶的生化试剂，水质的好与坏直接影响了复溶后工作液的稳定性和测定重复性。目前除了一些大城市的三级医院有自制的试剂级的蒸馏水外，别的医院很难获得符合试剂级要求的水，这就对干粉、片剂试剂的实际使用造成了一定影响。目前临床化学检测中许多项目已经开始用酶法进行分析测定，而试剂中许多酶在水溶液中是比?quot;脆弱"的，许多杂质都会影响酶活力，如①水中F会引起某些酶失活；②水中的重金属离子会影响酶活力；③水中某些微生物会引起酶失活，除了水中某些"杂质"会引起试剂中酶失活、部分失活而导致稳定性、重复性下降外，有些"杂质"会直接影响测定结查，如水中含有NH4便会直接影响尿素氮测定的准确度。全液体型生化试剂，在使用过程无需任何辅助试剂及蒸馏水，这就保证避免了外源水质而引起的对试剂的影响，保证了试剂在有效期内的稳定和测定结果的可靠。
（四）试剂组分高度均一
试剂中每一组分均一性是影响试剂测定重复性的一个重要因素。在干粉、片剂与冻干生化试剂生产过程要使每一试剂中十几种组分（有的组分含量相当微量）分布相对均匀也是一个技术难度较高的课题。在每一种试剂生产过程中必须解决：①原料干粉生产过程中每一组分的均匀性（冻干生化试剂在冻干分装前由于是液体的，每个组分是相当均匀）。②在分装过程中由于加样误差引起的均匀性问题（这一问题在冻干分装过程中同样存在：在片剂生产过程中体现为每一片剂重量误差）。③在使用过程中，由于需加入复溶水，复溶水的加样误差也会造成瓶与瓶之间同一组分浓度不尽一样。上述三个原因或其中一个原因都会造成实际测定过程中的瓶间误差，从而引起测定重复性下降。液体型的生化试剂从生产到使用全是液态，这就保证了每一个组分相对均匀，哪怕是十分微量的组分，这就避免了实际操作中的误差，能提高试剂测定的重复性。第二节 临床生化诊断试剂的制备
诊断试剂（包括标准品）的质量是影响分析质量的一个主要因素，因而在试剂研制生产过程中推行标准化的要求是保证试剂质量的关键所在。
一、标准品的制备
（一）标准物质应具备的条件
1．必备的主要条件 ①纯度高；②定值准确可靠；③稳定性好，在保管、使用有效期内其示值误差不超出证书的许可范围；④均一性好，任何一份分装的小样品都具备整个标准物质的特性指标。
2．附加条件 ①摩尔质量尽可能大；②具有符合使用目的之反应特性；③制造简便，价格低廉，购买方便；④标准物质的组成若发生变化（如吸潮）时，可采用重新干燥（恒重）等措施使其复原。
美国国家标准局（NBS，1998年改名为国家标准和技术研究院）批准的多种供医学检验用的一级标准物质见表6-1。
表6-1 NBS用于临床化学的部分标准物质
编 号 参 考 物 质
SRM
SRM910 丙酮酸钠（98.7%）
SRM911b 胆固醇（99.8%）
SRM
SRM913 尿酸（99.7%）
SRM
SRM915 碳酸钙（99.9%）
SRM
SRM
SRM918 氯化钾（99.9%）
SRM
SRM920 D-甘露醇（99.8%）
SRM921 皮质醇（氢化可的松）（98.9%）
SRM922 三羟甲基氨基甲烷（99.99%）（pH标准）
SRM923 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（99.69%）（pH标准）
SRM924 碳酸锂（100.0%）
SRM925 4-羟基-3-甲氨基-DL-苯乙醇酸（VMA）（99.4%）
SRM926 冻干牛血清白蛋白（99.4%）
SRM927 牛血清白蛋白溶液（70.48±
SRM929 二水葡萄糖酸镁（镁5.403%）
SRM935 结晶重铬酸钾 吸收比
SRM936 二水合硫酸奎宁 荧光光谱标准
SRM938 4-硝基苯酚（规定吸收波长为401nm）
SRM956 用于选择电极法的人血清中电解质水平，钠121.9、141.1、160.8mmol/L，
钾6.03、4.03及2.05mmol/L）
SRM
SRM998 人血管紧张素Ⅰ（94.1%）
SRM1598 人血清中无机组份（铜0.72μg/g，铁2.55μg/g，镁20.0μg/g，钾196μg/g，铷0.17μg/g，锌0.89μg/g，铝3.7ng/g，镉0.089 ng/g，钴1.24 μg/g，锰3.78 ng/g，钼11.5 ng/g，硒42.4 ng/g）
SRM1599 抗痉挛药物测试标准，3种浓度（Valproic酸14.5，69.1及142.5mg/ml，卡马西平2.8、8.8及19.4 mg/ml）
SRM
SRM1951 冰冻人血中胆固醇（5.440，6.266及7.292mmol/L）
SRM8430 天冬氨酸氨基转移酶（AST）从人红细胞提取（96.1U/L）
（二）标准液的配制
1．标准液配制的依据 供临床生化常规测定用的标准液属于二级标准物质，其示值的准确性对检验质量有重大影响，必须在标准物质选择、恒重方法程序、基质（包括水）的质量、最优化的配方和制备工艺上都要严格按照我国卫生部医政司主持编写修订的《全国临床检验操作规程》（1997年5月，第二版）的要求进行。
2．标准液的质量鉴定 不论是实验室自行配制或厂家生产的标准液，都需要认真地按照国家卫生部的规定做好质量检定。提出的规范化的要求和质量检定标准，并在标准液制备过程中应该严格检定程序，使其达到质量标准。
（三）标准液的正确使用
1．应采购诊断试剂正规生产厂家生产的商品标准液，尤其有国家卫生部生产文号的产品。
2．一瓶标准液只能使用一次，避免反复冻融、反复使用，尤其是标准物质稳定性较差的标准液（如尿素、葡萄糖、胆红素、白蛋白等）以及标准液的基质易挥发的标准液（如用无水乙醇配制的胆固醇标准液等）更应注意。
3．定值质控血清只能用于临床生化室内质量控制及室间质量评价，不能用作常规分析的标准物质，也不能用于相应物质含量的标化或仪器分析性能准确性的评价。
4．按照各种标准液不同保存条件妥善保管，并在其有效期内使用。
二、试剂中常用工具酶的质量保证
（一）工具酶的概念
工具酶是指作为诊断试剂来测定化合物浓度或酶活性的一类酶。它是酶试剂
的核心，它的质量是酶试剂质量的决定性因素。在临床生化领域里，目前已设计出几百种酶试剂系统和测定方法，用于200多个临床生化检验项目，使酶试剂方法成为最有发展前途的分析方法。可以预见，在不远的将来，现有的临床生化分析方法将基本上被酶试剂方法所取代。
（二）工具酶的来源和理化特性
临床生化酶试剂中的工具酶主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。在早期，酶多由含酶丰富的动植物组织提取；在当代，除了脲酶、过氧化物酶、乳酸脱氢酶等分别由豆类种子、辣根和心肌中提取外，工具酶主要依赖微生物发酵工程获得。微生物发酵工程包括高产酶菌种的筛选、放大培养和酶提取纯化三个部分。
不同来源的同一种工具酶有不同的理化特性。为了更有效地发挥工具酶的催化效能，形成最佳的酶试剂配方，必须确切地掌握该酶对底物的专一性、分子量、等电点、Km、最适pH、最适温度等理化特性参数，并熟悉辅助因子、激活剂和抑制剂对酶活性的影响。
（三）工具酶的纯度要求
不同的酶试剂系统对工具酶的纯度有不同的要求。以NADH的生成或减少作为指示反应的测定系统中，由于组织匀浆中往往含有NADH-细胞色素C还原酶，它将消耗NADH而出现干扰反应，因此要求该测定系统的工具酶有较高的纯度。而在Trinder反应中，由于人体液中氧化酶较少，产生副反应的机会较少，因此对测定系统中工具酶的纯度要求相对低一些。衡量工具酶纯度的要求指标是：
1．酶的比活性 酶的比活性是评价酶纯度的最好标准，即每毫克（酶）蛋白所具有的酶活性（U/mg）。酶的比活性越高，酶的纯度越高。一般要用推荐的酶活性测定方法测定。
2．杂酶含量 为了兼顾工具酶的较低生产成本和保证酶试剂质量，对工具酶中容易引起副反应的其他酶（即所谓杂酶）含量提出了"允许限度"的要求（见表6-2），但是目前尚未有国家卫生部或中华医学检验学会的推荐标准。
三、缓冲液的配制
（一）缓冲液的组成
缓冲液是临床生化诊断试剂的重要组成部分。由于它对外来的H+和OH-有双向调节作用，因而能为酶试剂中的待测物质反应提供最适pH，以利于这些酶最大限度地发挥其催化效能；也为以酸碱指示染料作为显色剂的试剂提供稳定的pH环境，以保证这些试剂和方法有准确可靠的测定结果。
一般的缓冲剂都由一共轭酸及一共轭碱组成。"酸性"缓冲液含有一弱酸及其盐（共轭碱）；"碱性"缓冲液含有弱碱及其盐（共轭酸）。共轭酸和共轭碱一起可阻止溶液pH发生剧烈的变化。当向溶液中加入H+时，共轭碱可与之部
分地结合而生成共轭酸，H+不再成游离状态存在；当加入OH-时，则共轭酸与之结合生成水及共轭碱，使OH-不再以游离状态存在而影响溶液的酸碱度。
（二）缓冲液的缓冲容量
缓冲液维持pH恒定的效力取决于其缓冲容量的大小。缓冲容量是指使
表6-2 常用工具酶的理化特性及质量要求
名称 来源 分子量 等电点 比活性要求（U/mg） 杂酶的允许限度
葡萄糖氧化酶 A.nigen 186000 4.30 ＞20 蔗糖酶含量＜0.01%，过氧化
（GOD） P.notatom 152000 氢酶＜10U/mg蛋白
已糖激酶（HK） 酵母 105000 4.50～4.80 ＞140 磷酸葡萄糖异构酶＜0.01%
G-6-PDH＜0.01%
葡萄糖-6-磷酸 酵母 212000 4.50 ＞140 CK、磷酸葡萄糖异构酶＜0.02%
脱氢酶（G-6-PDH）
过氧化物酶（POD） 辣根 40200 7.20 ＞50 不含胺氧化酶及过氧化氢酶
脲酶 巨豆 483000 4.90 5～100 天冬氨酸酶≤0.02%，精氨酸酶
≤0.002%，NH+4≤0.0005μg/U，
谷氨酸脱氢酶 变形杆菌 300000 4.60 ≥90 醇脱氢酶、LDH、MDH＜0.01%
（GLDH）
乳酸脱氢酶 心 135000 4.5～4.8 ≥500 ALT＜0.01%，PK、醛缩酶＜0.001%
（LDH）
脂蛋白脂肪酶 心 50394（人） ＞100 ATP酶＜0.00008%，NADH氧
（LPL） 假单胞菌属 47000 5.95±0.05 128 化酶＜0.001%，COD＜0.002%，
过氧化氢酶＜0.02%
甘油激酶 嗜热脂肪 209000 ≥85 NADH氧化酶＜0.001%，
（GK） 芽孢杆菌 HK＜0.02%
磷酸-3-甘油 足球菌 76000 4.6±0.1 ＞40 乳酸氧化酶≤0.001%
氧化酶
胆固醇酯酶 假单胞菌 302000 ＞25 ATP酶＜0.00008%，GOD＜
（CEH） 0.00001%，NADH氧化酶＜
0.001%，尿酸酶＜0.00004%，
过氧化氢酶＜1U/mg
胆固醇氧化酶 链霉菌 34000 5.1～5.4 ＞25 CEH＜0.005%，GOD＜0.00014%，
（CHOD） 尿酸酶＜0.0004%，NADH氧
化酶＜0.0007%
胆红素氧化酶 疣胞漆斑菌 52000 4.10 ＞0.2
（BOD）
尿酸酶 肝 100000 6.30 ≥15 过氧化氢酶＜1.0%
丙酮酸氧化酶 260000 4.30 ≥1.5 ATP酶≤0.05%，ALT、AST≤0.05%
被稀释或加入中性盐时，其pH能基本维持恒定。在一般情况下，将缓冲液稀释1倍，其pH值只改变一个pH单位的百分之几；加入0.1mol/L中性盐溶液，只使pH值大约改变0.1。但是温度的改变不可忽视，如0.025mol/L混合磷酸盐缓冲液（用GR磷酸二氢钾
（三）配制缓冲液的注意事项
1．所有试剂最好选用分析纯或优级纯，并必须恒重后方能配制。具体的恒重方法因试剂种类而有不同，如：①琥珀酸、甘氨酸、巴比妥及其钠盐放在氯化钙干燥器中至恒重；②用柠檬酸钠（含2H2O）及柠檬酸（含H2O）不需恒重直接配制其溶液；③无水醋酸钠，在
2．所用仪器必须清洁，容量仪器最好经过校正，以保证准确。
3．配好的缓冲液必须用酸度计校正其pH值（准确至小数点后两位）。如对其浓度有怀疑时，则应用滴定法检查其浓度。
第三节 临床生化诊断试剂盒的选择
一、试剂盒的性能指标
（一）准确度
通常以回收率、定值血清的靶值范围、对照试验及干扰试验的结果来分析判断。
1．回收试验 回收率越接近100%，准确率越高，一般以100%±5%为合格。
2．定值血清的测定 对于某些无法准确加入标准物的试剂盒，可用低、中、高浓度的定值血清进行测定，测得值符合定值血清的靶值范围（ ±2S）为合格。
3．对照试验 将被检试剂盒与公认的参考方法同时测定若干样本（一般要求100份，最少需30份），计算两组结果的相关系数和直线回归方程。相关系数γ越接近1.0、斜率b越接近1.0，截距a越接近0，则准确度越高。相关系数要求在0.9～1.0之间，γ值符合要求不等于准确度都符合要求。b表示比例偏差，a表示恒定偏差。（1-b）×100%表示比例偏差的大小。（a值/样品含量）×100%表示恒定偏差的大小。
4．非特异性与干扰试验 对维生素C、黄疸、溶血、乳糜等因素的耐受程度，干扰值越小越好。
（二）精密度
试剂的瓶间差异、批内精密度和批间差异三组测定的平均值之间应无显著差异，否则，试剂盒的均一性不符合要求。
1．瓶间差异 同一试剂盒，取10瓶试剂复溶，测定同一样品的含量，求平均值、标准差、变异系数。
2．批内精密度 同一样品用同一瓶试剂测定10次，求平均值、标准差、变异系数。
3．批间差异 同一样品，用不同批号的10瓶试剂测定，求平均值、标准差、变异系数。
（三）线性范围
指该试剂盒按其说明使用时可准确测量的范围。被检样品的含量超出测定线性范围，必须改变样品与试剂体积的比例，重新测定才能得到准确结果。试剂盒的测定线性范围是衡量试剂盒质量的一个指标，也是正确使用该试剂盒的关键之一。试剂盒测定线性范围要求能覆盖该项测定的常见医学决定水平。测定线性范围太窄时，常规工作中需调整标本量，重做的标本多，造成人力、物力、财力和时间的浪费。测定线性范围也不必过大，否则，成本高，价格贵，原材料浪费。
观察试剂盒的测定线性范围时，应用真实标本如定值血清或标准液操作，高浓度标本含量应超过说明书上规定线性上限的20%，整个线性需要五组不同的浓度，每组均需测定三次，并求平均值。
（四）抗干扰作用
双试剂型试剂盒主要优点是抗干扰作用。如ALT双试剂盒的第一试剂能排除内源性丙酮酸干扰。此种试剂盒的第一试剂加入被检血清后，
（五）灵敏度
在终点法灵敏度以特定波长下
（六）稳定性
试剂盒稳定性是指试剂盒在规定条件下储存仍保持其性能指标的期限。该期限应符合规定的储存期。方法有以下三种。
1．原包装试剂的稳定性 按说明书的保存方法储藏，于不同时期取出一瓶复溶，测定试剂吸光度值、标准品含量、定值血清含量、线性范围、酶促反应时间曲线或化学反应速度时间曲线及其他性能指标，直到这些指标变化超出规定值的10%以上的期限，为原包装试剂的稳定期。
2．复溶后试剂的稳定性 将复溶试剂分别放在
3．不同温度下的保存期 将原包装试剂盒置
二、选购试剂盒的要求和注意事项
（一）选购试剂盒的一般要求
1．所采用的测定方法特异性好，灵敏度、准确度、精密度符合卫生部临床检验中心、IFCC、WHO等推荐的方法性能。
2．试剂盒的储存期至少为1年。
3．水溶性、低粘性、无腐蚀、无毒害、不爆炸、不易燃、不污染环境。
4．所用标准品或标准参考物符合卫生部临床检验中心、IFCC、WHO推荐的标准和要求。
（二）选购试剂盒的注意事项
1．首先要仔细阅读试剂盒的说明书，对试剂盒选用方法有所了解，科学研究工作时应选择参考方法试剂盒，医疗预防工作应选择推荐的常规方法试剂盒，或选择公认的测定方法试剂盒。此外，对试剂盒的组成、方法性能指标加以分析，是用于手工操作，还是用于自动分析仪。属于后者，其实验参数是否与本单位自动分析仪的实验参数相符。
2．有无卫生部的批准文号。凡已列入卫生部临床检验体外诊断试剂审批管理范围的试剂盒，没有生产批准文号的，不应使用。对有生产批准文号者，也需考察生产厂家的信誉。
3．对试剂盒的包装、理学性能、方法学性能指标进行考察和检测，并经实际应用。符合说明书规定及本室实验要求者方可选购。
4．根据本单位的日工作量、分析仪试剂用量、试剂复溶后
5．注意季节对试剂质量的影响。一般在气温较低的季节购买试剂，防止试剂盒在运输途中变质。
6．在确保试剂盒质量前提下，应选购价格低的产品。 第四节 试剂盒的性能评价方法
为了确保诊断试剂盒的质量，国家卫生部于1992年开始颁发了38种临床生化诊断试剂"质量检定暂行标准"，使诊断试剂的生产、检定和销售走上了规范化道路。
一、说明书审查
说明书是用户了解和正确使用试剂盒的指南。审查内容包括：①试剂名称；②用途；③测定原理和技术要求；④试剂盒内的包装内容；⑤适用仪器；⑥标本要求；⑦测定步骤及注意事项；⑧贮存的条件及有效期；⑨性能特征，包括准确度、精确度、特异性、受干扰的程度、线性范围、参考范围；⑩生产单位名称、地址、邮编及电话。
二、理学检验与评价
理学检验的内容有：①外包装应完整牢固，封口严密，标签清晰；②有详细的用户说明书，卫生部批准的生产文号，生产日期，有效期和保存条件；③粉剂型应均匀无凝块，不粘附瓶壁；④液体型试剂应无沉淀，无混浊，无渗漏；⑤复溶后或液体试剂的pH应符合标准规定。
三、性能指标的检验与评价
（一）线性范围的测定
试剂盒的线性范围，既是衡量其质量的重要指标，也是保证正确使用和鉴定试剂盒的关键指标之一。一般试剂盒的线性范围应能覆盖临床上的参考值范围和常见疾病的医学决定水平，以减少样品稀释重测的机会。一旦线性范围变窄即应废弃。造成线性范围变窄的原因常见的有：①生产中组份投料量不足；②生产后组分稳定性差；③运输和贮存不当等。（检验方法见第六章方法学线性评价）
（二）观察时间反应曲线
酶活性测定时用中等酶活性的定值血清，代谢产物测定时用稍高于参考值上限的标准液或定值血清，按说明书规定对样品进行测定，每2s～10s记录一次吸光度，连续监测15min。同时用蒸馏水代替样品做试剂空白的时间反应曲线）。以吸光度为纵坐标，反应时间为横坐标作图，观察动态期（包括延迟期、线性期、混合期）和平衡期出现、持续和终止的时间，分析有关的性能指标。
1．终点法 ①试剂空白的吸光度是否符合规定标准，否则会影响测定的精密度和准确度；②试剂空白的时间反应曲线应平坦，且无明显波动，否则，说明试剂本身不稳定，会导致测定偏差；③反应能否在规定的时间内达到平衡，达到平衡的时间应在终点法读取测定吸光度的时间之前。反应速度慢的原因，常为试剂中酶量不足或酶质量不好，或反应条件不是最适条件；④反应达到平衡后，吸光度最大并维持不变，这一期间为反应平衡期，终点法测定应在这一期间读取吸光度。
2．连续监测法 ①试剂空白值是否符合规定，吸光度下降型的反应，试剂空白吸光度应在1.5左右，吸光度上升型的试剂空白吸光度越低越好，不符合说明书中规定值者不宜使用；②试剂空白的时间反应曲线应平坦，吸光度变化（△A/min）应≤0.001，若大于此值，表明试剂本身分解变化，会使测定结果产生误差；③延迟期、线性反应期与设定的实验参数是否相符，若不相符应予修改；④观察时间反应曲线的斜率，通过定值血清，分析试剂盒的灵敏度。当试剂盒中底物浓度不足，辅助酶或指示酶的酶量不足或质量不好，反应条件不是最适条件等情况时，时间反应曲线斜率下降，灵敏度低，测定结果有严重比例误差，这种试剂盒无法纠正，不能使用。
（三）稳定性试验
稳定性是指试剂在不同状态和不同条件贮存后保持其测定准确性的能力。大多数试剂盒具有原包装形式和使用时的工作液两种形式，少数试剂盒的原包装即为工作液。评估试剂盒的稳定性应包括原包装和工作液在试剂盒指定条件下的稳定性（试验方法见诊断试剂盒的选择）。
试剂盒的稳定性与贮存条件密切相关，工作液的稳定性还和使用中污染与否有关，在评估时，须保持指定贮存条件并要严防污染。
其他还需做准确度试验、精密度试验和抗干扰试验，具体做法请参照方法学评价一章相关内容和本章试剂盒的性能指标。
四、试剂盒性能检测的要求
进行上述各项性能指标检测时，要求操作正规，使用的容器均经过校准，自动分析仪或分光光度计的波长、灵敏度、稳定性均符合要求，温度准确、蒸馏水合格，标准参考物含量或定值血清的靶值均经验证。因为测定值是否准确可靠，除与试剂有关外，上述这些条件都是影响因素，如果上述因素控制不好，试剂盒质量好，测定的结果也会出现较大误差。因此，在分析试剂盒性能检测结果时，要全面分析，排除了试剂盒以外的影响因素之后，才能说明是试剂盒本身的影响，切不可简单从事。当然，用公认的高质量同种试剂盒做对照，同样条件下与被检试剂盒同时测定相同样品，比较两种试剂盒测定结果的差异，有利于区别上述因素的影响，所以，设立此种对照，对评估试剂盒的性能是很必要的。
