第二章 临床生化实验技术
临床生化实验技术是临床生化检验工作的重要基础，是临床生化检验工作能够顺利进行的技术保障。临床生化实验室技术较多，本章主要介绍光谱检验技术、色谱检验技术、电泳技术、免疫学检验技术、电化学分析技术、生物传感技术等在临床生物化学中的应用及有关的注意事项。其目的在于巩固基础，加强新技术的学习，提高基础水平。为进一步做好临床生化检验工作打好基础。
第一节 光谱检验技术
光谱检验技术利用各种化学物质具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量的技术。根据物质对光谱响应特征的不同，可把光谱检验技术分为发射光谱分析技术、吸收光谱分析技术和散射光谱分析技术三大类。在临床生化检验中，光谱分析是一类十分重要的技术，应用极为广泛。它既可以研究物质的结构，也可以对特定物质进行定性或定量分析。一、吸收光谱分析法
吸收光谱是指波长连续分布的光透过物质时，某些波长的光被物质吸收而产生的暗线或暗带组成的光谱。利用吸收光谱对物质进行定量的技术称为吸收光谱分析法，是实验室最常用的分析技术之一。它操作简便、快速，线性范围较宽，应用广泛。目前最常应用的技术有可见－紫外分光光度法和原子吸收分光光度法。
（一）可见－紫外分光光度法
1．检测原理和方法 可见－紫外分光光度法的理论基础基于朗伯－比尔定律。可见－紫外光区一般是指波长从200nm至760nm范围内的光，其中小于400nm的是紫外光，该分析是根据物质的分子对光的吸收特性进行成分分析或分子结构分析的方法。在可见－紫外分光光度法中，通常在测定未知样品浓度的同时，与已知浓度的标准物作比较，可以利用公式As = K Cs b，Ax = K Cx b来计算结果，即比较法。其中A为吸光度， C为溶液的浓度，其下标s、x分别表示属标准物、待测物，k为常数，b为比色杯的光径。或将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，从标准曲线找出相对应的待测样品的浓度。
因为测定成分相同，分析过程一样，故K值相同；加之比色时使用同样的比色杯，所以测得标准品与未知样品吸光度的比值也就等于其浓度的比值，即
，
用对比法定量时，为了减少误差，选用的标准品溶液的浓度应尽可能接近于样品溶液的浓度。
另外，根据朗伯－比尔定律A = k b c,只要知道某物质的摩尔吸光系数 ，就可以用C = A / b公式直接计算物质的含量。
吸光系数物理意义是吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度。如果物质的浓度为1摩尔，厚度为
在分光光度法的建立中，首先要确定显色液的最大吸收峰。在其它条件不变的情况下，在一定波长范围内（紫外光为200nm-400nm，可见光为400nm-760nm）测定，并记录相应波长时的吸光度，然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，就是该反应液的吸收光谱（如图2-1），在吸收曲线上的峰称吸收峰，其对应的波长称最大吸收波长，即可确定该显色液的测得波长。当两种或两种以上的组分共存时，可出现吸收光谱重叠的情况，在测得某一组分时其它组分对它会有不同程度的干扰，此时可采用双波长法。如图2-2，吸收光谱相互重叠的a、b两组分。选择各自的测得波长λ1和λ2，使干扰组分在这两个波长处的吸光系数相同，而欲测组分在两波长处的吸光系数有显著的区别。用这样两个波长测得混合物溶液的吸光度差值 A，只与欲测组分的浓度成正比，而不受共存组分的影响。在测得波长λ1和λ2处测得混合物的吸光度分别是A
Aa+b ＝ A
因组分a在λ1和λ2处的吸光系数相等，即
Aa+b = Ab = Cb( 1b - 2b) = Cb· b
欲测组分b在两波长处的吸光系数相差愈大，则测得的灵敏度愈高。用双波长法还能消除样品溶液的背景吸收的干扰和混浊的干扰，提高测得的准确性。
近年来由于新的灵敏度高、选择性好的显色剂和掩蔽剂不断出现，一般不经分离过程即可直接比色测定；还可采用解联立方程法、等吸收点法等解决定量中的干扰问题。
2．分光光度计的光源检查和波长校正 分光光度计属于比较精密的分析仪器，使用要求比较严格。其中单色光的纯度和波长的准确性直接影响到测定的准确性和精密度。仪器的安装调试一般都要按照说明书进行。在此就光源的检查和波长的校正作简单的介绍。
（1）光源检查即波长初步检查：不论何种分光光度计在校正之前都要先检查光源。检查方法是将波长选定在580nm处，将狭缝开到最大（或打开光门），打开钨灯，在比色皿内插一片白纸片。当光源正常时，应看到均匀的黄色光斑，边缘清晰整齐；如果明暗不匀，形状异常，则应调节光源灯的位置。调节方法是放松灯座固定螺丝，一边小心地向各个方向移动灯的位置，一边观察光斑变化，直至出现明亮均匀的黄色光斑为止。如系751型或高级分光光度计，这种调试工作还因灯泡固定机构复杂而应更细致，调好后要固定好。每次换新灯泡时都需要新调整。
（2）波长校正：分光光度计的波长精度随不同类型而异，且受温度影响，故常常需要对波长进行校正，即检查波长刻度与实际波长之差是否保持在一定的范围内，否则将使测定的误差增大。波长校正的方法很多，常用的有：①用含某些特定元素的玻璃来较正。最常用的有镨钕玻璃、钬玻璃等。校正时将这种玻璃放在比色皿座上，以空气调0，测定几个吸收峰值的波长是否相符即可。最常用的为573nm与586nm的双峰和741nm、808nm等处，如与刻度不符，需要时应调节准直镜角度进行校正。一般可见分光光度计波长精度只有 3～ 4nm，在此范围内一般可不调整。②可利用某些标准溶液进行校正，如标准重铬酸钾溶液(在1000ml 0.05mol/L的KOH中溶解
表2-1 标准K2CrO4 在不同波长的标准吸光度值
波长nm 吸光度(A) 波长nm 吸光度(A) 波长nm 吸光度(A) 波长nm 吸光度(A) 波长nm 吸光度(A)
220 0.4559 280 0.7235 340 0.3143 400 0.3872 460 0.0173
230 0.1675 290 0.4295 350 0.5528 410 0.1972 470 0.0083
240 0.2933 300 0.1518 360 0.8297 420 0.1261 480 0.0035
250 0.4962 310 0.0458 370 0.9914 430 0.0841 490 0.0009
260 0.6345 320 0.0620 380 0.9281 440 0.0535 500 0.0000
270 0.7447 330 0.1457 390 0.6841 450 0.0325
(二)原子吸收分光光度法
基于光源辐射出具有待测元素特征谱线的光，通过原子化器，被其中待测元素的基态原子所吸收，根据吸收而导致辐射特征谱线光被减弱的程度来测定待测元素的含量。与其它分析方法比较，它具有灵敏、准确、操作简便、分析速度快、干扰少、无需化学反应和测量元素含量范围较广等优点，由于其检测灵敏度较高，操作也比较复杂，而且每种元素需要一种光源，因此在临床实验室一般应用较少，主要用于测定钙、镁、铜、铅、锌等机体微量元素，是目前这些元素测得的参考方法。在原子吸收分光光度法中，定量分析常用的方法有标准曲线法、直接比较法和标准加入法。其基本原理都是利用吸光度与浓度之间的线性函数关系，由已知浓度的标准溶液求得样品的浓度。
原子吸收分光光度计有单光束型和双光束型两类。主要由光源、原子化器、单色器和检测系统组成。空心阴极灯是目前使用的主要光源，工作时逐渐增加灯的电流以满足测定的要求，但高电流下放射谱线增宽会降低原子吸收的灵敏度，而且会缩短灯的寿命。最适宜的灯电流由实验决定，在放射强度稳定并有适宜的信噪比的条件下，选用较小的灯电流是有好处的。
在微量元素测定中，首先根据有关资料了解待测元素的灵敏度和检出限。对灵敏度达不到要求的可以选择最灵敏的吸收线，选用小的狭缝宽度，采用较小的灯电流和最佳火焰类型及状态等来提高灵敏度。测定物质溶解后干扰要小，易于喷雾和原子化，稀释后测定结果应在线性范围内。仪器通电后要预热30分钟，使光源的发射稳定。狭缝的宽度影响光的谱带宽度与检测器的接受能量，使用较宽的狭缝可以增加光强度，提高信噪比，改善检出限。当吸收线附近有干扰谱线与非吸收光存在时，使用较宽的狭缝会降低灵敏度。在火焰化法中，火焰的类型是影响原子化效率的主要因素。因此，需通过调节燃气与助燃气的流量获得最佳原子化条件，以达到最高的测定灵敏度。同时调节燃烧头的高度，使来自光源的光通过基态原子浓度最大的火焰区，从而获得最大吸收值。总之，一种元素的原子吸收法测定需要考虑仪器工作的各种条件，以期达到实验的最佳条件。二、发射光谱分析法
临床生物化学检验常用的有荧光分析法（fluorometry）和火焰光谱法。由于火焰光谱法操作麻烦，影响因素多，现已被简便可靠的离子选择电极法所取代，故这里主要介绍荧光分析法。
（一）荧光分析的基本原理
某些物质吸收了一定波长的光能后，独自从基态跃迁到激发态，此类电子经与同类分子或它种分子相互碰撞，消耗相当，而下降至第一电子激发态的最低振动能阶。最低能阶下降到基态，同时发射出比原来所吸收的频率较低，波长较长的光能，称为荧光。利用元素的原子所发射的共振荧光波长的差异，可确定元素的种类或物质分子中某种结构，从荧光的强弱可以测定物质的含量。荧光分析定量是基于荧光物质的稀溶液，在一定的温度下，当激发光的波长、强度、荧光测定波长以及液层厚度一定时，所测得的荧光强度F与该溶液中荧光物质的浓度C成正比，F=kC。采用标准曲线法或直接比较法，对荧光物质进行定量。在一定条件下，荧光物质的浓度愈大，发射的荧光强度也愈强。对荧光物质进行定量测定的方法称为荧光分析法。荧光分析的灵敏度比分光度法高，通常可达10
（二）影响荧光分析的因素
多种因素影响荧光分析，诸如温度、溶剂、溶液的pH及浓度均对荧光的强度产生一定程度的影响，因此，在进行荧光分析时应严格控制各种条件才能获得灵敏、准确的分析结果。①溶剂：配制溶液的溶剂除水外，常用的乙醇、环己烷、四氯化碳、氯仿、丙酮等溶剂中常含有荧光杂质，影响测定，必须经过重蒸馏等净化处理才能使用；②荧光物质的浓度：荧光强度与溶液的线性关系只限于很稀的溶液，符合下列方程：F＝kCI0，式中F荧光强度，C溶液的浓度， I0激发光强度， k荧光效率。对于较浓的溶液，荧光强度并不随浓度增大而增加，相反随溶液浓度增大而下降。当荧光物质浓度高时，分子间碰撞增加，使荧光强度减弱；另外，浓度较大时，激发光被照射表面的定量荧光物质所吸收，产生强烈的荧光，以致使后面的溶液不易受照射而不发光；③温度：大多数情况随温度升高时，使分子间碰撞次数增加，消耗分子的内部能量而产生自熄灭现象；反之温度降低时荧光强度增大。
（三）荧光分析技术的应用
荧光物质的最大吸收波长和最强荧光波长是鉴定物质的依据。该法灵敏度高、取样量少，因此被广泛应用于各领域，在临床生物化学检验中主要用于糖类、胺类、甾族化合物、DNA与RNA、酶与辅酶、维生素等物质的分析。由于该方法灵敏度高，影响因素多，临床检验中应用比较少。
测定荧光强度常用荧光分光光度计，它主要包括激发光源、一对单色器、比色杯和检测器等部件。作为激发光的光源要有足够大的分光强度而且在整个波段内强度要一致。在荧光光度分析法的建立时，首先要测绘荧光物质的激发光谱和荧光光谱。当测绘荧光激发光谱时，将荧光单色器固定在荧光最强波长处，调节激发光单色器波长，记录被测荧光物质溶液在不同激发光照射下所发射的某一波长的荧光强度变化，以荧光强度为纵坐标，激发光波长为横坐标作图，即为荧光激发光谱，实质上是荧光物质的吸收光谱。选择好激发光波长，并保持其强度不变（一般将激发光单色器固定在最大吸收波长处），调节荧光单色器，测量出在一定波长的激发光照射下荧光物质发射的不同波长荧光的强度，以荧光强度为纵坐标，荧光波长为横坐标作图，得到的荧光强度随荧光波长变化的曲线，称为荧光光谱，如图2-3。在荧光定量分析时，将激发光波长单色器固定在有荧光激发光谱所选定的激发光波长，将荧光单色器调节到由荧光光谱所选择的波长就可以进行溶液荧光强度的测定。为了使每次的测得结果有很好的重现性，每次应用同一基准物质对仪器进行校正。基准物质一般选择能发射出稳定的荧光，且荧光峰波长与被测物质荧光测得波长相近的物质，如测定维生素B1时，可用硫酸奎宁作基准物质；测定维生素B2时，可用荧光素钠作为基准。
三、散射光谱分析法
散射光谱分析法主要测定的是光线通过溶液混悬颗粒后的吸光度或光散射程度的一类定量方法。常用的方法有透射比浊法和散射比浊法两种。目前，在临床生化检验中主要用于免疫比浊法（详见本章第四节）分析。
第二节、电化学分析技术
电化学传感器在临床生化检验的应用中有着重要的地位。其原理是将电极浸入待测溶液中组成原电池，其中一支电极的电极电位与待测离子的活度有关，其关系服从Nernst方程，此电极称为指示电极；另一支电极是电位已知并且恒定的所谓参比电极,目前最常用的参比电极有甘汞电极和银-氯化银电极。
离子选择电极分析法（ion selective electrode，ISE）是利用电极电位和离子活度的关系来测定被测离子活度的一种电化学分析法。ISE法的核心是对被测离子选择性响应的敏感膜，膜的一面与被测离子的溶液相接触、另一面则与电极内所充的一定活度的被测离子溶液和内参比电极接触，膜内外的离子活度的差异引起离子从高浓度向低浓度迁移，从而产生电位改变，其数值可在等电流的条件下测定。
ISE具有如下特点：①选择性好，多数情况下共存离子的干扰小，组成复杂的试样往往不需分离处理即可直接测定；②灵敏度高，可达10-5～10-8mmol/L； ③线性范围宽，Na+为10-6～10-1mmol/L，K+为3 10-5～1mol/L，Cl-为5 10-5～1mol/L，Ca2+为3 10-5～1mol/L；④溶血、脂血及黄疸不影响测定，对有色、浑浊溶液都可进行分析；⑤设备简单，分析速度快，易于自动化，标本用量少，应用范围广。
一、离子选择性电极
离子选择性电极最常用的电极有以下几种：
1．玻璃膜电极 敏感膜由玻璃材料制成，是发现较早的ISE。由于其敏感膜的组成不同，现已有pH、Na+、K+ 、Li+、Ag+ 、 Ca2+、iCa2+、Mg等玻璃电极。分为固态和液态两种。Na+电极就是利用玻璃膜对离子的选择性透过制成的固态电极；而K+电极是在聚乙烯膜上结合缬氨霉素制成的液态电极。
2．气敏电极 二氧化碳气敏电极是由pH玻璃膜电极构成，在玻璃电极上围着蓄有碳酸氢钠薄液层的透气膜，透气膜允许二氧化碳扩散进出碳酸氢钠溶液，从而引起pH的变化，便可测定二氧化碳的含量。其他的还有测定氨、氯、二氧化硫、二氧化氮、氟化氢等气敏电极
3．酶电极 是指一类将酶固化在电极表面制成的生物传感器。这类传感器将固化酶层和化学传感器结合在一起，不仅具有不溶性酶体系的优点，而且具有电化学电极的高灵敏度，在许多实际分析中能够省去样品预处理手续直接测定。在酶电极法测定葡萄糖中，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下被氧化生成葡萄糖酸内酯和过氧化氢，而氧的消耗或过氧化氢的生成均可被氧电极或过氧化氢电极测得，从而以间接方式得知样品中葡萄糖的含量。常用的酶电极还有测定尿素、尿酸、肌酐、维生素C、乙醇、乳酸、蛋白质等酶电极。
二、离子选择性电极法的测定及影响因素
由于离子选择电极在技术方面的优越性和制造技术的进步，电极的稳定性和寿命大大增强，有的电极还是免维护的，因此，最新临床化学分析系统倾向于多电极组合和智能化。电解质、血气和酶电极（主要是葡萄糖、尿素和乳酸传感器）集中在同一台设备中，犹如一个小型实验室。利用这种设备，同一标本一次便可以完成所有的测试。同时也可以有选择地做其中的某一项或几项测定。相应的选择性电极多采用毛细管流通式，少数采用平面棒式结构。电极还具有良好的能斯特响应和测量精确度，相对标准差低于2%。固态离子选择性电极寿命一般超过一年，有的甚至达到3～4年。液态膜选择性电极寿命短些，但大多数也在一年左右。氯电极的离子交换剂不够稳定，寿命仅为半年。
离子选择电极法根据测定原理分为直接敏感电极法和间接测定法。直接敏感电极法是该电极对被测物质有直接响应；间接测定法则是将适当的化学反应与现有的电极技术结合起来的测定方法，这种方法的临床应用已越来越多。离子选择电极法根据标本情况又可分为直接法和间接法。直接法是用离子选择电极直接测定生物体液中的被测物质；间接法则是将标本进行预稀释，然后再进行测定，使得标本的使用量更少。间接法由于将标本进行了预稀释，可以控制其离子强度，也就是控制其活度系数，但间接法由于标本被稀释，测定结果比直接法大约低4%-7%。
影响离子选择性电极法测定准确性的因素很多，下面介绍几种主要的因素：
1．离子强度 离子选择性电极法实际测量的是离子的活度，而临床则是以离子的浓度报告结果，二者之间的系数则是活度系数，而活度系数又是溶液离子强度的函数，因此，必须保持标准液与标本之间的离子强度的一致性。
2．溶液的pH值 溶液的pH值的变化可影响待测离子在溶液中的存在状态，从而影响测定的准确性，如离子钙的测定。
3．温度 温度的变化对离子选择电极电位的影响称为温度效应。主要表现在①影响电极是响应斜率、标准电极的截距、溶液待测离子的活度系数以及参比电极电位和液接电位；②影响电活性物质的溶解度、检出下限；③影响活性平衡的移动以至溶液中待测离子的浓度发生明显的变化。
4．干扰离子 溶液中的共存离子影响反应液的离子强度从而影响了被测离子的测定；共存离子还可与待测离子消除络合物或发生氧化还原反应，导致待测离子的数量减少。
电解质分析仪一般都要求24小时开机，其目的是为了保持电极膜很好的水化，增加电极的稳定性；如果使用后经常关闭仪器，使得电极膜干燥，会加速电极膜的失效和产生测定中的漂移现象；仪器正常启动后，清洗管路，进行两点校准，每隔2小时自动单点校准一次；每天测定完后根据仪器的要求对电极进行必要的保养，去除护着在电极膜上的蛋白质等物质。
第三节、电泳技术
带电粒子在电场中的移动现象称为电泳(Electrophoresis)。带负电荷的粒子向电场的正极移动；带正电荷的粒子则向负极移动。电泳技术应用广泛，在临床生化实验技术中占有重要地位，主要用于蛋白质的分离、鉴定和定量。目前已经发展到自动化的电泳系统，整个电泳过程包括点样、脱色、扫描定量都实现了自动化操作。同时用半干胶技术取代液体缓冲液，使得电泳操作更规范简便，电泳结果重现性更好。
一、 电泳技术的基本原理
（一）原理
各种物质由于所带净电荷的种类和数量不同，因而在电场中的迁移方向和速度不同。利用物质的这种性质可以对物质进行分离和鉴定。带电的粒子在电场中移动时，受到两种力的作用：第一，是电场中的力，它能使带电粒子移动，第二，是移动的粒子和溶液介质之间产生的摩擦力。粒子在电场中运动的速度和它所带的净电荷及电场强度成正比，和溶液的粘度与位移的大小成反比。即在相同的电泳条件下，只要粒子所带的净电荷不同，或粒子的大小不同，就有可能借助电泳而被分离。所以，对于给定的颗粒和电泳条件，迁移率是描述物质在电泳中行为的特征常数。
（二）影响颗粒电泳迁移率的因素
1．缓冲液 缓冲液应选用使分离的物质稳定，而且不与其发生反应的体系。缓冲液的pH直接影响分子的解离和带电性质、状态，因而会影响迁移率和分离效果。缓冲液的离子强度，一般以0.05mol/L～0.10mol/L浓度为宜。离于强度低，产热少，电泳快，区带明显扩散；离子强度高，区带尖锐，泳动距离短，产热多。
2．电场强度 粒子在电场中的移动速度，与电场强度成正比。
电场中因施加的端电压不同，分为常压和高压电泳。常压电泳一般在500V 以下，电势梯度约为 10～20V/cm；高压电泳一般在500V以上，电势梯度约为20V/cm～200V/cm。高压电泳会产生大量的热，所以高压电泳仪有配套的冷却装置和安全防护装置。
3．电渗 在电场作用下固体支持物的相对移动称为电渗(electro-osmosis)。由于固体支持物多孔，常吸附溶液中的正离子或负离子，是溶液相对带负电或正电，在电场中，溶液就向正极或负极移动。所以由于电渗的影响，使带电粒子表观速度是带电粒子固有的泳动速度和电渗携带的移动速度的代数和。为此，常用不带电荷的有色染料或有色葡萄糖点在支持介质的中间区域，可观察到电渗的方向与距离，然后将移动距离自实验结果中扣除或增加，就可以校正因电渗产生的误差。电渗作用影响较大的有纸电泳，淀粉胶电泳，毛细管电泳等。二、电泳的类型及应用
电泳的分类方法很多，在这里主要根据支持介质分为纸电泳、薄层电泳（醋酸纤维素薄层电泳）、琼脂糖（琼脂）电泳、淀粉胶电泳等。下面介绍几种常用的和新近发展起来的电泳类型及其应用。
（一）醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维素是将纤维素的羟基乙酰化而形成的纤维素醋酸酯，有它制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。用醋酸纤维素薄膜作支持介质的电泳称为醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate electrophoresis）。它具有分辩力好，对蛋白质吸附极少，拖尾现象轻微；不吸附染料，对区带周围的染料能完全洗去，不干扰测得；样品需要量少、介质又可以透明后定量扫描等优点。故很适合临床大量用于分离血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、甲胎蛋白及同工酶等大分子物质的分离。
醋酸纤维素薄膜电泳操作简单。将薄膜用电泳缓冲液浸透后，吸去多余的缓冲液，把薄膜平放在两电极之间，两端浸在缓冲液中，血清蛋白电泳时样品一般点在靠负极的一端，电泳30分钟左右。然后把薄膜放在丽春红S或氨基黑10B的染料中染色。经脱色后干燥，将薄膜浸入液体甘油或用冰醋酸-乙醇透明后，用光密度计扫描定量。有的扫描仪采用反射式检测和激光作为光源，薄膜脱色后不需要透明即可进行扫描，简化了操作步骤，同时也减少了由于透明时带来的脱色现象，使扫描结果更准确，扫描后的薄膜也可以长期保持。许多自动化电泳系统采用该方法。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂和加速剂的作用下聚合而成三维网状结构的凝胶。常用的催化剂有过硫酸胺和核黄素，加速剂一般用四甲基乙二胺。凝胶网状的大小，决定于丙烯酰胺单体的浓度和甲叉双丙烯酰胺的浓度及两者的比例。C、T数值可以表示凝胶的机械性能、弹性、透明度。
；
式中a ：丙烯酰胺的量；b：甲叉双丙烯酰胺的量；m：溶液总体积；C：交联剂所占的百分比，T：丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的总浓度，即丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺在溶液中的百分比浓度。凝胶的孔径主要受总浓度T的控制，T值越大，孔径越小，机械性能越强。在T不变而甲叉双丙烯酰胺浓度为5％时，凝胶孔径最小。C 较大时，如 C为 20％，凝胶为乳白状。因此可根据分离物的分子大小选择，大多数蛋白质的分离效果随胶浓度增加而增加，一般使用的凝胶浓度为7.5％。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)分为圆柱型和平板型两类。根据凝胶系统的均匀性也可分为连续凝胶电泳和不连续凝胶电泳。两者的主要区别是：不连续凝胶有两层不同孔径的凝胶，电极槽中及两层凝胶中的所用缓冲液pH值不同，电泳时样品先在第一层胶中浓缩，此过程中凝胶各部分形成的电位也不均匀，从而形成一个不连续的凝胶电泳系统。
聚丙烯酰胺凝胶兼有电泳支持体及分子筛的功能，大大提高了分离能力，是目前分辨率最高的电泳支持体。它具有相对的化学稳定性，纯度高，溶解度小，无电离基团，受pH值和温度变化较少，几无吸附及电渗现象，并可通过改变交联度而调节孔径大小范围。它能精细地分离各种蛋白质组分。在蛋白质的电泳中，为了使被测物质的泳动速率的大小完全取决于分子量，在电泳系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS)以消除或减少电荷对蛋白质移动的影响。
聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于：蛋白质分子的分离鉴定、蛋白质分子量的测定、核酸的分析（非解离体系）、核酸的序列测定（解离体系）以及尿蛋白电泳等诸多方面，是目前最常用的电泳技术之一。如果是蛋白电泳，一般使用考马斯亮兰R250染色，也可以用银染，但银染一般背景较深；如果是用于分离核酸，一般用溴化乙啶染色，值得注意的是溴化乙啶有致癌作用。
（三）琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是从琼脂中去掉杂质和能沉淀脂蛋白的琼脂果胶后所得。它是半乳糖及其衍生物构成的中性物质。琼脂糖作为电泳介质有许多优点，如物质在凝胶中的迁移率与液体介质相似，而凝胶结构却限制了对流的形成，因此分子在电泳后的位置可以保持不变，但又可以在凝胶中自由扩散，电渗作用小，对蛋白质的吸附极微，分辩率和重现性均较好，电泳图谱清晰。常用的琼脂糖凝胶的最适浓度为0.5%～1.0%,琼脂糖加热时溶解于电泳缓冲液中，趁热铺于玻璃板上，冷却凝固后即可使用。这样制成的凝胶透明度好、富有弹性，坚固而不脆。电泳后可直接干燥成薄膜后进行染色。因此是目前应用最多的电泳介质之一。商品化的琼脂糖凝胶板透明度好，散热均匀而且快，电泳重现性好，适当的条件可以保存半年。加之结合半干胶技术，电泳时可以不需要缓冲液，是目前自动化电泳系统最佳的介质。由于琼脂糖支持层上的区带易于扩散，因此电泳后必须立即固定染色。
为了增强区带的不溶性以及加强与染料的结合力，将电泳后的凝胶板浸入以70%乙醇配制的2%醋酸溶液中15～20分钟，进行固定，使蛋白质变性而不再扩散。琼脂糖常用的染料根据电泳目的和对灵敏度的要求不同，可以选用丽春红S、氨基黑10 B或考码斯亮兰等，考码斯亮兰比前二者有较高的灵敏度，但脱色较难。另外也可以选用银染，它的灵敏度更高，但由于染色操作烦琐，凝胶背景深等原因而不常用。
琼脂糖凝胶电泳除用于蛋白质的分离测定外，还可以用于糖蛋白、脂蛋白及同工酶等的分离测定。特别是在免疫分析中，与免疫技术结合，可用于抗体的鉴定及效价的测定（免疫电泳）、对抗原组成和抗体特异性的分析（交叉免疫电泳）和抗原的定量测定（火箭电泳）。
（四）其它几种电泳技术
1．等电聚焦电泳 两性电解质的载体，在电场中可以形成一个连续的pH梯度。蛋白质具有多解离基团，在不同pH下处于不同的电荷状态。当周围环境的pH值低于蛋白质的等电点（pI）时，蛋白质呈正电性，在电场中向负极移动，在移动过程中，正电性逐渐减弱，直至零，此时蛋白质移到了pH等于pI的区域，不再移动。反之，溶液pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质呈负电性，在电场中向正极移动，最终也将停在pH等于PI的区域。只有当溶液的pH等于蛋白质的等电点，为电中性，蛋白质在电场中才不移动。利用蛋白质的这个性质，将其放在由两性电解质形成的pH梯度中，可以依不同蛋白质的等电点不同达到分离的目的。
进行等电聚焦电泳的关键是要建立一个合适、稳定、连续线性的pH梯度。这要借助一种人工合成的小分子两性电解质，其结构中含有多氨基、羧基或磺酸基，在电场中可以形成广泛的pH梯度。两性电解质的选择须根据蛋白质的等电点而定。如知道某种蛋白质的pI值，即应选择包括此时在内的小范围的两性介质；如不清楚测定或分离的蛋白质的pI值，则可采用pH值较广的（pH 3～10）的两性电解质。待了解pI后，再选用窄范围的两性电解质，以便获得较高的分辨率。
等电聚焦电泳的分辩率很高，可达0.001pH单位，主要用于样品组分较复杂但pI不同的蛋白质的分析，如血红蛋白和同工酶的分析。
2．毛细管电泳 毛细管电泳是近年来发展起来的一项技术，被誉为90年代最有影响的分离手段之一。该方法具有高效、快速、微量和易于自动化等特点，是对传统电泳技术的一个重大突破。毛细管电泳，除具有一般的电泳迁移外，还受到毛细管电泳时电渗的影响。毛细管电泳的电渗是指在高电压下，由偶电层中的水合阳离子引起的流体向负极方向的移动。所以毛细管内的粒子运动，受到两方面的作用：①电场的作用；②电渗流的作用。正离子迁移方向与电渗方向一致，所以正离子在毛细管内的迁移速度加快。负离子迁移方向与电渗方向相反，离子的迁移速度，决定于泳动速度和电渗作用的大小。由于电渗流速一般远大于泳动流速，因此在毛细管电泳中，负离子也总是向负极移动。中性粒子的泳动速度为零，所以中性粒子随电渗而行。中性物质的速度可以用于测定电渗作用。
毛细管电泳的另一个特点是采用了极细的管子（2～75μm），样品用量少（2μl），这样即使使用很大的电压（12 000V），在一定程度上也能缓解由高压电场引起的产热问题，进而克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散问题，实现了分离速度快（10 min）、分离效率高。随着荧光检测仪、电离质谱分析仪的应用，使得毛细管电泳系统实现了高度自动化，检测灵敏度大大提高（pg级）,操作简便，实现了在位检测。随着制造技术的发展，毛细管电泳从一支毛细管发展到目前的96支毛细管同时分离，增大了样品的处理能力。
目前，毛细管电泳已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成寡核苷酸、DNA酶切片段及PCR产物的分析鉴定、DNA顺序测定等，在生物大分子和小分子的分离分析及临床检测等方面也有广阔的应用前景。
第四节、常用免疫分析技术
随着单克隆抗体的开发和使用、各种标记技术的发展使得免疫学进入了一个新的时期。由于免疫分析技术具有特异性好、快速、灵敏度高等，其应用范围十分广泛，在临床生化中可以测定内分泌激素、蛋白质、多***、核酸、神经递质、受体、肿瘤标志物、血药浓度等血清微量物质。
一、免疫比浊分析
带有小颗粒的悬浮液和胶体溶液都具有向四面八方散射入射光线的性质，散射光谱分析法就是利用悬浮颗粒的混浊液的散射光强度或对入射光减弱的原理进行定量分析的方法。其测定方法类似比尔定律，常规应用主要有：透射比浊法和散射比浊法两类。由于颗粒的大小和形状及悬液的稳定性对比浊结果有较大的影响，不能直接用比尔定律进行测定，按照雷莱(Rayleigh)方程式，小颗粒的散射光强度是与波长的四次方成反比，否则会引起误差。
(一).散射免疫比浊分析
散射比浊法（nephelometry）是指一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时遇到抗原抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射，发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物颗粒大小和多少密切相关。散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测抗原越多，形成的复合物越多，散射光强度越强。散射光的强度不仅与散射核心（颗粒）的大小和数目有关，而且与各种物理因素，如加入抗原（或抗体）后的时间、光源的强弱和波长（单色性）、测量角度等因素都密切相关。散射比浊法分析，是免疫比浊分析中最常用的一种方法。
1．散射颗粒与散射光的关系 悬浮在反应溶液中的分子，无论是固体或胶体粒子都可以是散射中心，当入射光通过时，如果颗粒直径比入射光的波长小很多，则散射光比较均匀的分布于颗粒的四周，称为Rayleigh散射（如图2
a.Rayleigh散射(颗粒直径 入射光波长) b.Mile散射（颗粒直径 或 入射光波长）
图2-4 散射颗粒与散射光的关系
在散射比浊的设计中，多采用的是Rayleigh原理，即散射光的强度与复合物的量呈正比，同时也和散射夹角成正比，与波长呈反比。因此，在散射比浊中，增加抗原一抗体复合物颗粒的大小，减小入射光的波长，扩大散射夹角等，都可使检测的敏感度增加。体液中的蛋白质分子颗粒大小不等，与抗体形成不溶性复合物后的颗粒大小也不均等，但大多数蛋白质分子的波长比光的波长要小得多（仅5 10nm），只产生Rayleigh散射，因此，测定由Rayleigh散射产生的散射光，就可以准确地确定到由小的蛋白质颗粒产生的散射光，排除其他大颗粒的干扰。
2．反应物含量与散射浊度 抗原-抗体结合反应中，遵守典型的Heidelberger曲线(如图2-5)，亦即当抗体量恒定时，抗原与抗体结合，形成免疫复合物的反应与散射信号响应值的上升呈正比。同时，散射信号亦随抗原抗体结合反应时间增加而曲线上升。当抗原量与响应值上升至一极限值时，若再增加抗原量．已形成的抗原．抗体复合物会发生溶解而使散射响应值迅速下降。因此，在采用抗原一抗体结合反应测散射浊度时，一定要保持抗体过量，以维持抗原一抗体复合物的相对不溶解性，同时测定的散射信号值应是在散射信号响应值曲线的上升臂部位。
自动化特种蛋白分析仪多采用散射比浊分析技术，散射光检测角度从70 到90 不同。检测方法有速率法、终点法和固定时间法。有的仪器还增加了近红外激光光源（600～940nm），测定前向的散射光（0 角），用抗体包被的乳胶颗粒检测极微量的蛋白质，避免了小分子颗粒的干扰，同时采用竞争抑制法分析，提高了检测的灵敏度，线性范围也增加，加入的抗体量也相对减少。以前很难测定的类风湿因子、IgE等都以准确的定量测定。特种蛋白分析仪可以根据实验参数的设定自动稀释样品，检测到抗原过剩时能对样品进行自动稀释后重测，同时自动减去本底信号。
（二）透射免疫比浊分析
透射比浊法（turbidimetry）的基本原理是测定一定体积的溶液通过的光线量（光通量），当光线通过时，由于溶液中存在抗原一抗体复合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光的减少，测定的光通量和抗原抗体复合物的量成反比。在透射比浊中，测量的是透过不溶性复合物到达探测器而未被散射或吸收的光线，测定角度与正前方夹角为0°。
该方法的测定原理：试验中设计检测抗体过量，待测样品中的Ig在反应介质中与相应的检测抗体发生抗原一抗体反应，形成可溶性复合物，在聚乙二醇（PEG）的作用下，加速抗原一抗体复合物的形成和稳定性，使反应介质的浊度发生改变，利用分光光度计测定光线被吸收的量，待测样本的抗原含量与吸光度成正比，光通量与抗原含量成反比。利用标准品做出标准曲线，待测样本的浊度变化可在标准曲线上计算出来。
（三）免疫比浊分析的临床应用
临床主要用于检测血浆、体液中的特定蛋白系列，如免疫球蛋白IgG、lgA、IgM反应抗体的体液免疫功能； 、 用于M蛋白病的诊断； 补体C3、C4反应补体的消耗情况；前白蛋白（prealbumin，PA）可作为营养不良和肝功能不全的指标；α1－抗胰蛋白酶（α1－antitrypsin，AAT）缺乏者可发生年青人肺气肿、新生儿和成人肝损害；转铁蛋白（transferrin，TRF）用于贫血的鉴别诊断；炎性反应蛋白SAA、C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、载脂蛋白、尿微量蛋白系列和一些小分子量的治疗性药物浓度等。这些特定蛋白成分的定量检测，可为临床诊断与治疗提供有效的病理生理指标，而且是临床诊断，判断治疗效果，分析预后的依据。因此，在保证检测结果准确性的同时，应对这些指标的临床应用价值，与疾病发生发展之间的关系，标本采集时可能影响正确检测的因素等有较全面的了解，才能更好的利用这些病理生理指标，为疾病诊断和协助治疗提供更好的服务。
二、酶免疫分析
酶免疫分析（enzyme immunoassay，EIA）是将酶催化的放大作用与抗原、抗体的免疫反应相结合的一种标记免疫分析技术。与放射免疫（radioimmunoassay,RIA）相比其最大优势在于避免了放射性核素对人体的伤害，核素标记的抗原或抗体批间差异大，酶标记物具有明显较长的有效期和不需特殊设备等。近年来在EIA中又引进了放大系统，派生出荧光酶免疫分析、增强化学发光酶免疫分析等，使检测的灵敏度大大提高。
（一）酶免疫分析的分类和原理
酶是一种能催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效率超过目前所用的人造催化剂；此外，酶还具有高度的专一性。酶标记抗原或抗体后，既不影响抗原或抗体的免疫反应特异性，也不改变酶本身的催化活性。在测定时，把待测样品（测定其中的抗原或抗体）和酶标记抗原或抗体反应，按不同的步骤与固相表面的抗原或抗体结合，经洗涤后，加入酶反应底物；底物被酶催化产生呈色反应，呈色的深浅与样品中待测物质的量直接相关，故可以进行定量分析。
EIA测定主要用于液体中抗原或抗体的定性或定量分析。EIA技术种类繁多，分类方法也很不一致，根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的或游离的酶标记物而分为非均相酶免疫分析（heterogeneous－EIA）和均相酶免疫分析（homogeneous－EIA）两种类型。
在均相EIA分析中，当酶与半抗原联结形成的酶标记物与相应的抗体反应后，由于抗体分子的空间阻碍效应或因酶的结构发生变化而激发或妨碍了它与底物的作用；当加入样品后，样品中的半抗原竞争性地与酶标记物反应的抗体结合，此时酶标记物就不再结合抗体分子，从而使酶标记物解除了激活或抑制状态。在此实验中不需分离即可直接检测发生特异性免疫反应的酶的活性，并计算出样品中半抗原的含量。均相EIA技术由于不要求分离结合和游离的标记抗原或抗体，可减少因物理分离而引起的误差，操作步骤简单快速，便于自动化分析，检测灵敏度一般为10-9mol/L，主要用于小分子半抗原如药物和激素的测定。其主要缺点是由于没有物理分离结合和游离标记抗原或抗体的步骤，样品中非特异性的干扰物质如内源性酶、酶抑制剂及有交叉反应的抗原等较容易影响测定结果。另外，由于采用竞争性结合的反应原理，其测定的灵敏度不如非均相EIA高。
非均相EIA技术是目前应用最广泛的EIA方法，又称酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。其原理是基于抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。根据反应原理的不同分为竞争性和非竞争性两大类。①竞争性非均相EIA：酶标记抗原（或抗体）和待测抗原（或抗体）共同竞争包被在固相载体上的抗体（或抗原），固相抗原（或抗体）结合酶标记抗体（或抗原）的量与待测抗体（或抗原）的浓度成反比。可以应用酶标仪进行超微量测定。方法简单快速，不需离心，非特异结合低。②非竞争性非均相的EIA：是目前应用最广、最普及的一种EIA技术，其技术特点是：首先使用过量的固相包被抗体（Ab）与样品中的待测抗原(Ag)结合，洗去未结合的其他物质后，加入酶标记抗体(Ab*)，后者即结合到已与固相抗体结合的抗原上，洗去多余的酶标记抗体后，加入底物(S)使其显色(S*)后检测固相上结合的酶活性，酶活性的强弱与被测抗原的浓度呈正相关，这就是双抗体夹心法（如图2-6）。均使用固相分离技术，减少了各种反应物质的相互干扰。由于有两种单克隆抗体来确认待测物的结构，所以特异性很高，同时还具有简便、快速的优点。近几年来发展起来的一种特异性抗体检测技术――双抗原夹心法，反应原理与双抗体夹心法类似，只是固相包被和酶标记的是抗原。该方法主要用于如丙型肝炎病毒（HCV）抗体，艾滋病毒（HIV）抗体，梅毒抗体等的检测。
（二） EIA在临床生化中的应用
EIA具有特异性好，检测敏感性高，酶标记试剂比较稳定，检测快速简便等特点，而且可以与化学发光、免疫荧光等技术相结合，整个操作过程可以实现自动化处理（包括加样和加试剂、洗板、检测和结果计算），彻底解决了EIA操作烦琐、技术要求高等问题。加之商品化的试剂盒的大量开发，使其在临床检验中得到广泛的应用。目前EIA主要用于治疗药物（如地高辛）、激素（如性激素）、维生素、酶和同工酶、受体、肿瘤相关抗原、自身抗体、细菌、病毒、寄生虫和基因工程产物等的超微量、微量、半定量、定性、或定量分析。
三、化学发光免疫分析
化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）在近十年来得到了很大发展，与微离子发光酶免疫分析(microparticle luminescence immunoassay, MLIA)、生物发光免疫分析(bioluminescence immunoassay, BLIA)、增强化学发光分析(enhanced chemiluminescence, EC)和电化学发光分析(electrochemical luminescence, ECL)等相比，以其灵敏度高（可达10-18mol）、检测速度快、操作简便、所用试剂对人体无危害的优点，成为非放射性免疫分析技术中最具有发展前途的方法之一。
（一）化学发光免疫分析的基本原理
化学发光指化学反应引起的发光现象，当物质吸收化学反应过程中释放的化学能之后，能使自身分子受激发而发光；如在生物体中产生此种能源来自生物活体的发光现象，称为生物发光；若产生发光信号的能量来源于电激发，如从多环芳烃的自由基阴离子上除去一个电子，往往产生激发状态的中间物质，当其回到基态时，将产生光辐射，此种发光称为电化学发光。化学发光反应所发出的光的强度依赖于化学发光反应的速度，而反应速度又依赖于反应物的浓度。因此，通过检测化学发光强度可以直接测定反应物的浓度，从而进行物质的定性和定量分析。化学发光与荧光的根本区别是形成激发态分子的激发能源不同。荧光是发光物质吸收了激发光后使分子产生发射光，化学发光是化学反应过程中所产生的化学能使分子激发产生的发射光。因此，化学发光反应中反应过程必须产生足够的激发能是产生发光效应的重要条件。
（二）化学发光兔疫分析中的标记物质
化学发光免疫分析所使用的标记物根据其参与的化学反应不同，可分为三类：①直接参与发光反应的标记物；②以催化作用或能量传递参与发光反应的酶标记物；③以能量传递参与氧化反应的非酶标记物。后两者又称为间接发光。这些标记物应用在不同的发光免疫分析仪器中，了解它们各自特性有助于对不同原理的发光免疫分析在分析测定样品时的特性进行评价和选择。
1．直接参与发光反应的标记物 待测样品作为反应物，直接参与化学发光反应，如下式。待测样品A或B，通过反应产生激发态产物C* 当C* 跃迁回到基态时，辐射出光子。
A + B C* + D C* C + h
这类反应的标记物在化学结构上有产生发光的特殊基团，在发光免疫分析过程中直接参与发光反应。通常这类物质没有本底发光，在反应中能用于检测低浓度或微量浓度的样品。最常用的标记物主要有吖啶酯类。吖啶酯包括吖啶酯I、吖啶酯II和吖啶酰胺III，是一类发光效率很高的发光剂。吖啶酯I、II分子和吖啶酰胺III均可与抗体（或抗原）结合，生成具有化学发光活性强、免疫反应特异性高的标记抗体。
2． 以催化反应或能量传递参与发光的酶标记物 在这类发光反应中，采用某些酶作为标记物，这类标记物作为发光反应的催化剂或作为一种能量传递过程中的受体，其本身又直接参与发光反应。通常用酶标记抗体，检测反应中形成的抗原抗体复合物上的标记酶催化其反应底物后形成的产物，作用于发光物质产生化学发光。该被测样品的含量和发光效率的强弱与酶催化反应后形成产物的量密切相关。在该类方法中最常使用的标记酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）。
3．以能量传递参与氧化反应的非酶标记物 这类标记物作为化学发光反应的催化剂或能量传递过程中的中间体（或受体），不直接参与化学发光反应。在这类反应中参与能量传递反应的标记物含量与免疫反应中抗原-抗体复合物形成的量呈正相关，并直接与反应底物产生的光子强度相关，该体系中的发光物质在激发态与基态的活动越强，产生的光子就越多，其发射光的强度与被检测物的浓度呈正相关。最常用的有三联吡啶钌标记物。
A + B C* + D C* + F F* + E F* F + h
（三）在临床生化免疫检测中的应用
无论是化学发光酶免疫测定，微粒子化学发光免疫测定和电化学发光免疫测定，目前都是采用将发光技术与免疫反应和计算机技术完美结合的自动化仪器分析，在这些分析技术中，由于其操作的智能化程度高，敏感度高、特异性强、精密度和准确性均可高于RIA，特别是检测灵敏度高，快速，检测试剂稳定并易于进行质量控制，目前已成为免疫检测广泛采用的分析技术。随着近年来各试剂厂家不断推出许多新开发的诊断试剂盒，使其检测项目涉及面越来越广，可用于内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标志物类、治疗性药物浓度、骨代谢指标和贫血类等方面的检测，是目前免疫化学应用最为广泛的新技术。四、时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析（time-resolved fluoroimmunoassny，TRFIA）以镧系元素为标记物，因此又称之为"解离一增强镧系荧光免疫分析"（dissociation－enhancement lanthanide fluoroimmunoassay，DELFIA）。它是一种全新的非放射性标记免疫超灵敏度的检测技术。其主要特点是以稀土元素铕（Eu3+）标记抗原或抗体为示踪剂。利用增强液的荧光放大作用和时间分辨荧光测量法排除样品或试剂中非特异性荧光物质的干扰，最大限度地提高了荧光信号测量的特异性和检测方法的灵敏度，最小检出值可达10-17mol/L。具有操作方法简便，标记物制备容易，稳定性好，不污染环境和易于自动化等优点。目前主要用于蛋白质类、酶、***类激素、甲状腺激素、类固醇激素、药物等的定量检测。
（一） 时间分辨荧光免疫分析原理
通常在检测样品中，含有各种蛋白质和其他化合物，这些物质在较大波长范围内都可产生自发荧光，如血清蛋白可发射短波长荧光（激发波长为280nm，发射波长为320nm～350nm），而胆红素等化合物可发射较长波长荧光（激发波长为330nm～360nm，发射波长为430nm～470nm）。这些荧光属于非特异荧光，其荧光素寿命短，一般为lns～10ns，最长不超过20ns，因此，普通荧光素发射的荧光与非特异荧光的荧光寿命属于短寿命荧光，在本检测中称背景荧光。
镧系离子有铕、衫（Sm3+）、镝（Dy3+）等，其荧光寿命很长（10us～1.0ms），比背景荧光长3～4个数量级。所以应用荧光的时间分辨技术在背景荧光已经降到很低时再开始检测稀土鳌合物的荧光，从而消除了非特异性荧光的干扰。另外，较大的Stocks位移（即激发光波长与发射光波长之差）和较窄的发射峰等都增大了检测的信噪比。由于使用解离-增强原理（即镧系元素鳌合物被解离后形成一种处于保护性的胶态分子团中新的高强荧光鳌合物）使得检测的灵敏度进一步增加，可达5 10-14mol/L。
（二） 时间分辨荧光免疫分析的主要分析方法
1．双位点夹心分析法 以甲胎蛋白（AFP）为例。采用针对AFP分子上不同决定簇的两种单克隆抗体，一种抗体包被在微孔板上，另一种用作制备抗AFP-Eu3+标记物。在微孔板中加入待测样品和标记物，AFP通过其两个结合位点分别与固相和标记物中的抗AFP结合，结合到固相上的抗AFP-Eu3+标记物与AFP含量成正比，洗涤除去游离的标记物；加入增强液，用时间分辨荧光测定仪测定固相上结合标记物的荧光强度，它与AFP浓度呈正比。一系列AFP标准品用于制作标准曲线，通过样品荧光强度可以从标准曲线查出样品AFP含量。
2．竞争分析法 以皮质醇测定为例。Eu3+标记抗皮质醇抗体，微孔板上包被皮质醇。在微孔中加入样品和Eu3+标记物，样品与固相上的皮质醇对有限量抗皮质醇-Eu3+标记物进行竞争性结合，Eu3+标记物与固相结合量与样品皮质醇含量成反比，洗涤除去游离的Eu3+标记物，加入增强液，用时间分辨荧光仪测定荧光强度，荧光强度与样品皮质醇含量呈反比。一系列皮质醇标准品用于制作标准曲线，根据样品荧光强度可以从标准曲线查出皮质醇含量。
（三）时间分辨荧光免疫分析的临床应用
TRFIA技术在实验室应用中已经取得较大的突破，全自动的时间分辨荧光免疫分析仪和多种商品化试剂盒的问世为TRFIA技术的临床应用提供了必要的条件。由于它具有灵敏度高、重复性好、检测线性范围宽、信号稳定和荧光寿命长等优点，使得以前难以定量测定或测定不理想的物质可以方便的检测。蛋白质和多***激素如Ig E、HCG、促黄体生成素、催乳素、促甲状腺素、胰岛素等可以用双位点夹心法测定；半抗原的物质如皮质醇、地高辛、甲状腺素、雌二醇等一般用竞争法测定；另外还可以用于病原体抗原、肿瘤标记物等的测定。由于时间分辨荧光免疫技术优点突出，发展迅速，将逐渐取代放射免疫分析技术。第五节 其他检验技术
临床生化实验技术很多，除上述介绍的技术外，还有离心技术、层析技术、生物传感技术和生物芯片技术等，这里选几种适用的技术作简要介绍。
一、离心技术
离心机是利用物质的高速旋转时产生强大的离心力，使置于该旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离的目的。离心机的种类繁多，用途各异。
（一）离心分离的原理
需离心分离的生物样品，常预先制成悬浮液。将处于悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等称为颗粒。每个颗粒都有一定大小、形状、密度和质量。当离心转子高速旋转时，这些颗粒在介质中发生沉降或漂浮，它的沉降速度与作用在颗粒上的力的大小和力的方向有关。颗粒除受到离心力外，还受到颗粒在介质中移动时的摩擦阻力与离心力方向相反的浮力，即颗粒处于重力场之下的重力和与重力方向相反的浮力。此外，还有周围介质小分子的作用力，当颗粒很小时，介质分子对颗粒的作用力十分明显，要使这种小颗粒沉降，需要更大的离心力。
在离心场中，作用于颗粒上的力主要有①离心力（Fc）：离心力的大小等于离心加速度与颗粒质量的乘积。②重力：是颗粒重力与重力加速度的乘积。③浮力：是指被物体所排开的周围介质的重量。颗粒的浮力与离心力方向相反，为颗粒排开介质的质量与离心加速度的乘积。当离心转子从静止状态加速旋转时，原来处于悬浮状态颗粒的密度大于周围介质的密度，则颗粒离开轴心方向移动，即发生沉降；如果颗粒密度低于周围介质的密度，则颗粒朝向轴心方向移动，即发生漂浮。无论发生沉降或漂浮，离心力的方向与摩擦阻力和浮力方向相反，当离心力增大时，反向的两个力也增大，到最后离心力与摩擦阻力和浮力平衡，颗粒的沉降（或漂浮速度）达到某一极限速度，这时颗粒运动的加速度等于零。颗粒的沉降速度与颗粒直径的平方，颗粒密度和介质密度的差值以及离心加速度成正比，而与介质的粘滞度，颗粒偏离球形的程度成反比。在离心加速度不变的情况下，颗粒的沉降速度主要决定于颗粒的直径大小和颗粒的形状，而颗粒的密度所起作用较小。
颗粒在单位离心力作用下的沉降速度，称为沉降系数，用s表示。沉降系数的单位以1 10-13s=1Svedberg单位，以1S表示。例如蛋白质的沉降系数为4.5S即4.5 10-13s，IgG为7S即7 10-13s等等。沉降系数的物理意义又是颗粒在离心力作用下从静止状态到达极限速度所经过的时间。
一个重量单位时的离心力称为相对离心力（RCF），RCF = 1.118 10-5 x (rpm)2，其中，x 为离心机转子的半径，以cm为单位，rpm为离心机转速。
（二） 离心机的应用
目前在生物医学领域内常用的离心机种类繁多，按其离心转子能到达最高转速分类有：低速离心机（在6 000rpm以下），高速离心机（在25 000rpm以下），超速离心机（在30 000rpm以上）。在超速离心机中，根据用途不同，又可分为制备型、分析型和制备分析两用型。制备型和分析型超速离心机的主要区别在于分析型有附设的光学系统，可以在离心分离过程中通过光学系统，将大分子的沉降行为以扫描或照相的形式记录下来，有的有观察镜，在可见光波段内直接观察颗粒的沉降行为。
制备超速离心机常用的离心转子有四种：固定角度转子、水平转子、垂直转子和区带转子。这四种转子的性能和用途有一定的差异，正确选择转子有利于获得良好的实验结果。
低速离心一般使用玻璃管，它抗化学药品的性能极好，但一般较脆，不能承受3
随着计算机技术在离心机上的应用，离心时的加速及离心后的减速都由CPU控制，根据离心样品的不同要求可以选择不同的加速和减速曲线。逐步使用无级调速无电刷直流电机，辩证运行更平稳，同时避免了频繁的更换电刷。离心机的使用最重要的是平衡，大多数离心机会检测离心时是否平衡，如果不平衡性超过要求，离心机将自动停止并用声音和字幕提示。为了防治对人体的意外伤害，多数离心机设计了运行时可以锁闭的盖，只有运行完全停止时才允许打开机盖。当离心有害或有机溶剂污染的样品时，离心管要加盖，离心机吊桶有密封套。
二、高效液相层析法
高效液相层析法(High Performance Liqiud Chromatography; HPLC)是用特制微粒（<10um）充填的层析柱作为固定相，通过高压使液体流动相快速通过层析柱而达到快速有效分离液相中各种物质的层析技术。它具有分离效果好、分析速度快，检测灵敏度高等特点。在医药卫生和生物化学中得到广泛的应用，蛋白质、糖类、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等大分子以及高分子聚合物都能用HPLC测定。
典型的高效液相色谱仪包括输液系统、进样分离系统、检测系统和数据处理系统等部分组成。流动相用一高压泵输入，由于流动相液体中常溶有微量气体，脱去其中气体是很有必要的。在分离过程中按一定程序连续改变流动相的离子强度、pH和极性，以改变分离条件、提高分离效果、缩短分离时间，因此，需要两台高压泵。进样可以是注射器进样，也可以是进样阀进样。HPLC使用的检测器不少，但商品化的还不多，应用最多的是紫外或紫外－可见分光检测器，还有荧光检测器、示差检测器和电化学检测器等。
（一）方法原理
1．液固吸附层析法 在色谱柱中填充固体吸附剂，待测组分通过色谱柱时，不断地被吸附剂吸附和被流动相解吸附。基于不同组分非被吸附和被解吸附的行为差异，从而达到分离的目的。常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、弗罗里硅土等。
2．液液分配层析法 系在固体填充颗粒上涂上一层薄薄的固定液，待测组分在固定相和流动相之间进行连续的分配萃取，由于被分离物质在两相间的分配系数不同而达到分离目的。
3．离子交换层析法 在色谱柱中填充离子交换树脂。带电离子随流动相经色谱柱时，与带有异性电荷的树脂有一定的亲和力而得以适当保留。由于各种离子与树脂的亲和力不同，其保留行为也不同，从而得以分离。
（二）临床应用
高效液相层析法是目前最好的血药浓度监测方法，但在实际应用中还存在一些问题，如每遇到一个新药必须摸索测定的最佳条件；各种药物的测定条件不同，要不断的更换流动相甚至色谱柱；每次只能测定一种药物，至多只能测定一类药物，无法测定性质不同的药物。因此，高效液相层析法用于常规血药浓度监测，只适用于少量常用的某些特定药物，大大限制了它的推广应用。鉴于临床的需要，国外一些公司设计了自动高效液相色谱仪，该仪器具有如下优点：①固定色谱柱和流动相，使一台仪器适合多种药物的检测。②利用计算机技术，储存几百种药物的图谱，能自动识别未知药物。③为提高图谱鉴别能力，该机利用了三维光谱、出峰时间等多种手段。④自动进样系统使仪器自动定量或定性测定，分析多达50个样品。
三、生物传感技术
生物传感器（biosensor）是指固定化的生物体内成分(酶、抗原、抗体、激素等)或生物体本身（细胞、细胞器、组织等）为敏感元件组成的传感器。生物传感器的主要特点为①生物传感器是用选择性好的生物体材料作为敏感材料，因此一般不需要进行样品的前处理，一般也不需另加其他试剂，使用简便、快速、准确；②由于它的体积小，可以实现连续在位检测，联机操作；③响应快，样品用量少，且由于敏感材料是固定化的，可以反复多次使用；④传感器连同测定仪器的成本远低于大型的分析仪，便于推广普及。
生物传感器根据利用的生物物质的不同可分为两类。一类是利用酶、细胞内小器官、细胞、组织等具有辅酶特性物质的生物催化传感器，酶传感器、微生物传感器和组织传感器属于此类；另一类是抗体、结合蛋白质、激素受体、DNA、RNA等具有亲和性物质的传感器，免疫传感器、受体传感器、DNA传感器属于这类。
（一）酶传感器
这类传感器将固化酶层和化学传感器结合在一起。葡萄糖传感器是典型的酶传感器，溶液中的葡萄糖扩散进入酶膜而被葡萄糖氧化酶迅速氧化，生成过氧化氢，过氧化氢被气体电极所检测。通过所测过氧化氢的量就可以对溶液中葡萄糖进行定量。
组成酶电极时，要根据被测物选择所用的酶，而基础电极的选择，则应根据酶促反应的产物来决定。酶电极的选择性（或特异性）决定于所用的酶对被测物的特异性，而酶电极的灵敏度、线性范围等则主要决定于基础电极的性能。目前使用的主要酶电极有：葡萄糖测定电极，胆固醇和胆固醇酯测定电极，乳酸测定电极、乙醇测定电极等。酶传感器具有以下优点：①酶可以反复使用；②可以用简单的操作迅速测定；③可对微量的样品进行测定；④可进行定量测定；⑤可用于比色法比较难测的混浊样品；⑥由于直接变成电信号，有利于控制和自动化测量等。
（二）微生物电极
直接利用微生物细胞内复合酶系统作为传感器的识别部位。它具有以下特点：①微生物体内所含的酶是处于最适条件下，只要微生物存活，其体内的酶即可保持较高的活性，因此，微生物电极的寿命要比酶电极的长。②微生物来源方便，成本低，微生物电极的价格也要比酶电极低得多。③微生物体内含有多种酶和酶的辅助因子，是个复合酶体系。既可以利用微生物体内的某一种酶为敏感材料作成传感器也可以利用整个体系为敏感材料制成传感器。④从原则上讲，固定化的微生物在接近失效（微生物大部分死亡）时，可以再生。⑤做生物电极的选择性不如酶电极。
微生物电极的工作原理可分为两种类型：一种是利用微生物的呼吸活性，另一种是利用微生物的代谢产物，以前者为多。利用呼吸活性的微生物电极是借测定微生物摄取被测物（底物）时样品液中溶解氧的减少量，来测定被测物的量，这种微生物电极的基础电极是氧电极。利用微生物代谢产物的微生物电极，其产物必须是某种电极（例如CO2电极）的活性物质，根据产物的量来推测被测物的量。
（三）组织电极
是用动植物组织切片作为敏感元件的电化学传感器。与酶电极相比，组织电极有如下优点：①动植物组织中的酶是处于最佳的状态下，且相当于被固定化，酶不易流失，活性又高。②组织材料易于获取，其价格要比纯化酶低得多。③对于无法分离纯化的酶的生化反应体系，组织电极尤其有独到之处。④制备简单，组织切片用适当方法保存，其寿命可达一年以上。这类电极可以测定维生素C、谷氨酰氨、细胞色素C和腺苷等。
（四） 免疫电极
免疫电极是用固定化的抗体或抗原为敏感元件，用电化学电极为信号转换器所组成的一类电化学生物传感器，用于识别和检测相应的抗原或抗体。目前使用的免疫电极主要用于血清蛋白、细菌、病毒、肿瘤标志物、激素、维生素、药物、毒物等的检测。
四、生物芯片技术
生物芯片（biochip）是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多***分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。由于常用玻片/硅片作为固相支持物，且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片技术。根据芯片上的固定的探针不同，生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片等。另外根据原理不同，还有元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。如果芯片上固定的是***或蛋白，则称为***芯片或蛋白芯片；如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或DNA，就是DNA芯片。
生物芯片技术的基本原理是把制备好的生物样品固定于经化学修饰的载体上，然后与标记的样品分子杂交，根据各探针分子杂交信号的强度来确定样品分子的数量和序列信息。
（一）、生物芯片技术的操作要点
1．芯片制备 芯片种类较多，制备方法也不尽相同，但基本上可分为两大类：一类是原位合成；一类是直接点样。原位合成适用于寡核苷酸；直接点样多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。与原位合成法比较点样法较简单，只需将预先制备好的寡核苷酸或cDNA等样品通过自动点样装置点于经特殊处理的玻离片或其它材料上即可。
2．样品制备、杂交和检测 待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必需进行分离、扩增及标记。根据样品来源、基因含量及检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法各异。为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记，目前采用的最普遍的荧光标记方法与传统方法如体外转录、酶联聚合反应（PCR）、逆转录等原理上并无多大差异，只是采用的荧光素种类更多，这可以满足不同来源样品的平行分析。用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上目的基因的荧光信号，通过计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。检测扫描仪根据原理不同可分为两类：一是激光共聚焦显微镜的原理; 另一种是CCD摄像原理。前者的特点是灵敏度和分辨率较高，扫描时间长，比较适合研究用；后者的特点是扫描时间短，灵敏度和分辨率较低，比较适合临床诊断用。
杂交条件的选择与研究目的有关，多态性分析或者基因测序时，每个核苷酸或突变位点都必须检测出来。通常设计出一套四种寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，根据每套探针在某一特定位点的杂交严谨程度，即可测定出该碱基的种类。如果芯片仅用于检测基因表达，只需设计出针对基因中的特定区域的几套寡聚核苷酸即可。表达检测需要较长的杂交时间，更高的严谨性，更高的样品浓度和低温度，这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度。突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要更高的杂交严谨性和更短的时间。
（二）、生物芯片技术的应用
l．基因测序 人类基因组计划的实施促进了高效的、自动化操作的测序方法的发展，芯片技术中杂交测序技术是一种新的高效快速测序方法。目前认为人类疾病或健康状况都与一定的基因相关，并有许多试验证明，一种疾病都有其相应的致病基因或易感基因存在。这样就能通过基因检测对疾病进行基因诊断和基因治疗。
2．新药开发 高通量的DNA芯片可发现众多的新基因和新的靶分子用于新药的设计。目前第一个生物分子工程药物Herceptin已用于乳癌的治疗，并获得美国FDA的批准。除肿瘤外，用分子生物工程设计的药物可用于治疗遗传病及代谢疾病、抗衰老、设计新的抗生素和工业用酶等。
3. 寻找新基因 定量监测大量基因表达水平在阐述基因功能、探索疾病原因及机理、发现可能的诊断及治疗靶等方面是很有价值的。如该技术在炎症性疾病类风湿性关节炎(RA)和炎症性肠病(IBD)的基因表达研究中，由RA或IBD组织制备探针，用Cyt3和Cyt5荧光素标记，然后与靶cDNA微阵列杂交，可检测出炎症疾病诱导的基因如TNF-α、IL或粒细胞集落刺激因子，同时发现一些以前未发现的基因如HME基因和黑色素瘤生长刺激因子。
生物芯片技术虽然还处在初期发展阶段，它的飞速发展正在逐步改变着人们对生物体的认识，随着这一技术的深入发展，它将对临床疾病诊断、疾病发生机理的认识和新药开发都将是一个重要的研究手段。但仍然存在着许多难以解决的问题，例如技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低，重复性差、分析范围较狭窄等问题。这些问题主要表现在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等几个方面。
