发展了又一种新型生物反应放大技术。由于BAS亲和力高,所以具有高灵敏度、高特异性和
稳定性等优点，在现代生物免疫学领域中已得到广泛应用，并显示出明显的优越性。已报
道有用于放射免疫、免疫荧光和免疫电镜等技术中，但应用更多的还是在酶免疫技术中。
BAS用于检测的基本方法可分为三大类。第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应
体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。第二类以亲和素两端分别连接生物素化大
分子反应体系和标记生物素，称为BAB法，或桥联亲和素-生物素法(BRAB)。第三类是将亲
和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接
触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法。尽管方法很多，但在
目前国内主要还是BAS-ELISA法。特别是其中的BA法和ABC法用得较多。至于其它标记材
料(如荧光素、铁蛋白和血蓝蛋白等) 的BAS检测系统，只要制备或得到了相应标记物，再
根据BAS的基本原理及基本方法即可自行探索建立实验程序。为节省篇幅，兹只介绍BAELISA
法。
(一) 原理
BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B)与亲和素(A)间的高度放大作
用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为
68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物素很
易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体
的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用
而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。
(二) 操作步骤
方法一 用于检测未知抗原的BA-ELISA:
1. 包被抗体：用0.05M PH9.6碳酸盐缓冲液将已知抗体作适当稀释，在每个聚苯乙烯
酶标板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜(18-24小时)。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3
次，每次3分钟(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加入待检样品(未知抗原)或作适当稀释的标准参考品于反应孔中，同时作空
白孔，阴性和阳性孔对照。37℃孵育１小时，洗涤。
3. 加B-Ab：已作适当稀释的生物素化抗体(B-Ab)，加于每孔0.1ml,37℃孵育30～60分钟。洗涤。
4. 加A-HRP：已作适当稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素(A-HRP)，于每孔加
0.1ml，37℃孵育30～45分钟。洗涤4次。
5. 底物显色：于上述各反应孔中加入临时配制的TMB(或OPD)底物应用液0.1ml，于
37℃10～30分钟。再加2M H２SO４ 0.05ml以终止反应。
6. 结果判定：目测或在ELISA比色仪上测OD值(见ELISA部分)。
方法二 检测未知抗体的BA-ELISA程序:
包被抗原：用0.05M PH9.6 碳酸盐缓冲液将已知的抗原作适当稀释，
于聚苯乙烯酶标板的孔中加0.1ml，4℃18-24小时。用洗涤缓冲液洗3次，每次3分
钟。
↓
加样：加适当稀释的待检样品（未知抗体）于反应孔中，同时作空白、
阴性和阳性对照孔。37℃孵育1小时，洗涤。
↓
加B-Ab2：加稀释过的生物素化抗抗体(抗人或鼠等的IgG)，每孔
0.1ml, 37℃30-60分钟，洗涤。
↓
余下步骤同测未知抗原的BA-ELISA。
(三) 试剂器材
1.生物素化抗体：可根据需要从生物制品所购买，也可以自制。本室制备生物素化抗
体的程序是：用0.1M NaHCO３溶液将纯化的抗体稀释为1mg／ml，将生物素酰-N羟基丁二
酰亚胺酯(BNHS，国内有售)用二甲基甲酰胺溶解，浓度20mg／ml，在1ml抗体溶液中加
BNHS液20μl，混匀后置室温(22℃)反应2小时，然后在4℃中对PBS透析24小时，滴定工作
浓度后即可使用。
2. 酶标记的亲和素：一般生物制品研究所均有销售，可按其说明书进行稀释及使
用。如果自行制备，可采用Wilson的过碘酸钠标记法，详见酶标记抗体部分。
3. 抗原、抗体和参考血清等。
4. 其它的试剂和器材可参考ELISA部分。
(四) 注意事项
1. 反应物的浓度及比例：由于本法敏感性很高，牥|括所用抗原或抗体均较ELISA法为
少，对生物素标记的抗体(或第二抗体)的浓度更应严格掌握，增加抗体浓度可使敏感性提
高，但过大又可使非特异性随之增大。
2. 生物素的稳定性：生物素标记上抗体的结合物，其稳定性均比酶标记抗体为好，
宜长期保存，加入等量60％甘油于-20℃可保存2年左右。保存时切忌反复冻融，反复冻融
会使制剂的活性受到损害。
3. 亲和素的稳定性：亲和素在一般条件下稳定，对热及多种蛋白质能耐受，但在某
些金属离子存在下对光敏感，容易失活。所以在配制亲和素溶液时宜采用无离子水，在4℃
置2个月或在-30℃置放半年，反复冻融其活性仍保持不变。
4. 亲和素的非特异性吸附：亲和素在PH中性环境中是带正电荷的，可通过静电作用
非特异性地吸附到固相载体上，这是引起试验非特异性显色的主要原因。如果增加亲和素
稀释液的PH和离子强度，均可明显减少亲和素的非特异性吸附，而对特异性显色也影响不
大。也可用戊二醛或醋酸酐对亲和素进行化学修饰，使之乙酰化而减少其非特异性吸附。
5. 反应物的作用时间及温度：由于亲和素与生物素之间有很高亲和力，故二者标记
物反应时间较抗原-抗体反应时间大为缩短。为了减少非特异性吸附，反应时间不宜过长，
一般于37℃以20-30分钟为宜。
4. 其它的试剂和器材可参考ELISA部分。
(四) 注意事项
1. 反应物的浓度及比例：由于本法敏感性很高，牥|括所用抗原或抗体均较ELISA法为
少，对生物素标记的抗体(或第二抗体)的浓度更应严格掌握，增加抗体浓度可使敏感性提
高，但过大又可使非特异性随之增大。
2. 生物素的稳定性：生物素标记上抗体的结合物，其稳定性均比酶标记抗体为好，
宜长期保存，加入等量60％甘油于-20℃可保存2年左右。保存时切忌反复冻融，反复冻融
会使制剂的活性受到损害。
3. 亲和素的稳定性：亲和素在一般条件下稳定，对热及多种蛋白质能耐受，但在某
些金属离子存在下对光敏感，容易失活。所以在配制亲和素溶液时宜采用无离子水，在4℃
置2个月或在-30℃置放半年，反复冻融其活性仍保持不变。
4. 亲和素的非特异性吸附：亲和素在PH中性环境中是带正电荷的，可通过静电作用
非特异性地吸附到固相载体上，这是引起试验非特异性显色的主要原因。如果增加亲和素
稀释液的PH和离子强度，均可明显减少亲和素的非特异性吸附，而对特异性显色也影响不
大。也可用戊二醛或醋酸酐对亲和素进行化学修饰，使之乙酰化而减少其非特异性吸附。
5. 反应物的作用时间及温度：由于亲和素与生物素之间有很高亲和力，故二者标记
物反应时间较抗原-抗体反应时间大为缩短。为了减少非特异性吸附，反应时间不宜过长，
一般于37℃以20-30分钟为宜。
