关键词：结核分枝杆菌;离心沉淀集菌涂片;漂浮集菌涂片;直接涂片
痰结核分枝杆菌阳性是诊断肺结核病的金标准，检查方法有痰涂片和痰培养。中国防痨协会1995年颁布的《结核病诊断细菌学检验规程》(以下简称《规程》) 推荐的痰涂片方法为直接涂片和漂浮集菌涂片法[1]。2 种方法的阳性检出率均较低。我们通过离心沉淀集菌涂片提高了结核涂片检测的阳性率。
材料和方法
一、试剂：萋尔－纳尔逊染色液。按文献配制[1]。
二、痰液的消化：痰液加入1～2倍的1.8%碳酸钠水溶液混匀。将痰瓶置于高压灭菌器中,21磅,15min 灭菌、消化(或置100°C 蒸气锅内消化30～40 min)。
三、离心沉淀集菌涂片法最适条件的确定取数份病人痰液消化后混合物约100ml,混匀,分成10 ml/份,采用不同离心力和离心时间的沉淀物制备涂片,根据抗酸染色结果确定最适条件为:离心力≥3 000g,离心时间15min。
四、方法：53例本院临床确诊的肺结核病人,男37例,女16 例,年龄20～73岁。取病人深咳痰5～6口(约10 ml) 于一次性塑料瓶内,送检。用离心沉淀集菌法制备涂片1 张,同时按《规程》推荐的直接涂片法、漂浮集菌涂片法各制备涂片1 张。抗酸染色后镜检[1]。
五、结果判定：油镜下观察3 种涂片,按《规程》规定的标准判断结果。300 个油镜视野内见不到结核分枝杆菌时为(-) ,见到1～2 条结核分枝杆菌时为(±) ,100个油镜视野内见到3～9条时为(+),10个油镜视野内见到1～9 条时为(2 + ) ,每个油镜视野内见到1～9条时为(3+),每个油镜视野内见到10条以上时为(4+)。
结果
一、离心沉淀集菌涂片法的最适条件：在离心时间为15 min 时,混合样品随着离心力从1 000g增加到3000g ,每视野结核分枝杆菌数从8 条增加到44 条,离心力再提高时,每视野结核分枝杆菌数不再增加。在固定离心力为3 000 g 时,随着离心时间从5 min 增加到15 min ,每视野分枝杆菌数从5 条增加到42 条,离心时间再延长时,每视野分枝杆菌数不再明显增加。因此确定离心沉淀集菌涂片法的最适离心条件为离心力≥3 000 g ,离心时间为15min。
二、53 例肺结核患者痰标本的检测结果：用3 种不同的涂片方法检测53 份肺结核患者的痰标本结果表明：离心沉淀集菌涂片的阳性率明显高于漂浮集菌涂片和直接涂片法。离心沉淀集菌涂片法的镜下细菌数明显多于另2 种方法,其阳性检出率(62.3%) 也明显高于另2 种方法
讨论
离心沉淀集菌涂片法能提高检测灵敏度。《规程》[1]中推荐的直接涂片中将0.1ml 痰液均匀涂成200mm2 (20 mm×10mm)面积的薄膜。而离心沉淀集菌涂片是将约5 ml痰液中所含结核分枝杆菌的大部分浓缩到0.1ml 沉淀中,其灵敏度可大幅度提高。这有利于结核病的早期发现。 从以上分析可以看出,离心沉淀集菌涂片法是痰查分枝杆菌的最有效的涂片方法,能大幅度地提高检出的阳性率。漂浮集菌涂片法阳性检出率最低,且该法在操作过程中使用有机溶剂易造成实验室环境污染,应予淘汰。直接涂片法阳性检出率虽低于离心沉淀集菌涂片法,但由于其操作简单,不需要昂贵的设备和高水平的实验条件,适合于卫生技术条件欠发达地区的技术人员使用。 应用离心沉淀集菌涂片法最主要点是足够离心力和离心时间,在一定范围内,细菌的检出率与离心力和离心时间成正相关,当离心力大于3 000g ,离心时间大于15 min 时,细菌的检出率基本稳定,这与娄峥等[2] 报道不一致。因此无须要求更高的离心速度和更长的离心时间。
