前言：Prion病是指由于细胞内正常型Prion蛋白发生高级结构变换,成为变异型Prion蛋白而引发疾病的总称。已知的人类Prion病包括人克雅病(Creutzfeld-Jakob disease,CJD)、Gerstmann-Strussler-Scheinker综合征(Gerstmann-Strussler-Scheinker syndrome,GSS)、致死性家族性失眠症(Fatal Familial Insomnia,FFI)等。

动物及人体尿液内的蛋白酶抗体PrP亚类对Prion疾病的影响

编译：袭莎

Gideon M. Shaked，Yuval Shaked，Zehavit Kariva，Michele Halimi，Inbal Avraham，Ruth Gabizon

Department of Neurology, the Agnes Ginges Center for Human Neurogenetics, Hadassah University Hospital, Jerusalem, Israel

通讯地址：Ruth Gabizon，Ph.D. Department of Neurology，Hadassah University Hospital，Jerusalem，Israel

传真：972-2-6429441   邮箱：gabizonr@hadassah.org.il

副标题：尿液中的Prion蛋白

 

摘要

PrPsc是目前唯一已知的Prion病的组成部分，其存在于动物及人体的脑部而导致Prion疾病。现在我们指出，在患有遗传海绵性脑病的鼠类、牛和人类的尿液中可检测出蛋白酶抗体PrP亚类。最重要的是，在临床症状出现前，接受prions接种的鼠类尿液中也发现了这种PrP亚类。有趣的是，接受UPrPSc接种的鼠类甚至在270天后并没有引发prion疾病的临床症状，这表明其在病原体中与在脑部PrPsc中是不同的。我们建议可在诊断人类及动物的潜伏prion疾病时使用UPrPSc检测法，同时也可以增加我们对体内PrPsc新陈代谢的了解。

关键词：尿液    Prion    PrP    诊断

 

引言

自从疯牛病在1985年出现，进行prion疾病诊断测试的需要变得很急迫。在没有此类方式时，大规模的屠宰牛时需要对受影响的动物进行确认，确定其在同一个畜群中。自从在1996年报告出第一例变种克雅二氏症的库贾氏疾病（变型库贾氏疾病），这种体内诊断的需求便不断增强。变型库贾氏疾病是一种致命性神经变异疾病，可以相信其是由进食受疯牛病污染的肉类所引起的，从受到感染到具有临床症状这段潜伏期可长达数十年。与牛相反，具有潜伏性的个体，（在这一点上可以是我们中的任何人），将会存在多年，在献血及其他器官捐赠中不会对其他人产生影响。

仅仅确定了prion的成分，引起prion疾病的介质（也可称为遗传海绵状脑病或TSEs）为PrP^Sc，PrP^C的一种蛋白酶异常抗体亚类。PrP^C是一个未知的糖基磷脂酰肌醇锚糖蛋白函数。虽然prion疾病的其他标志物已被指出，PrP^Sc不仅保留prion成分的专性，而且在家族遗传疾病中其是唯一可靠及公认的标志物。现在我们指出，PrP中的蛋白酶抗体亚类可命名为UPrP^Sc，在感染痒病的鼠类、感染牛海绵状脑病的牛和患有克雅二氏症的人类的尿液中，通过特殊的浓缩过程可检测出。这些结论为prion疾病体内初级检测的发展奠定了基础。

 

实验过程

尿液样本分析

尿液样本（鼠类2ml，人类10ml，牛15ml）在3000转数/分沉淀5分钟来分离细胞碎片，然后在透明管状膜（气孔范围6000-8000道尔顿，聚光科技；德克萨斯，美国）中加入5升生理盐水在4℃放置整夜进行透析。为了实验目标，（图1c），在某些案例中分析步骤被遗漏了。随后，尿液样本在高速（100000重力，1小时，4℃）下进行离心。球粒悬浮在100μl 2%sarkosy/ISTE（10毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸盐pH值7.5，10毫米氯化钠，1毫米乙二胺四乙酸）。样本被分类，在存在或缺失蛋白酶K（PK）中溶解。每个物种的溶解条件被优化。鼠类尿液，40μg/ml PK，60分钟，37℃；人类尿液，40μg/ml PK，30分钟，37℃；牛的尿液，20μg/ml PK，30分钟，37℃。

随之进行蛋白酶溶解，尿液样本在十二烷基硫酸钠样本液中煮沸，将其运用在12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随之转化为硝化纤维膜。这些膜被3%的全脂牛奶阻断，但是牛的样本除外，其被5%的人体血清蛋白（σ）阻断。第二个阻断过程是通过在TBST液中将1：3000抗小鼠IgG与1：3000抗兔子IgG混合进行的，以避免在某些尿液样本中出现非特异性二级抗体Ab与IgG轻链。然后这些膜在TBST中进行15分钟漂洗，在1:5000 6H4 (鼠类, 人类) 或1:5000 6H4(牛)αPrP mAb 3F4的免疫弱点。

体内实验

叙利亚仓鼠接种来自正常或患有痒病的仓鼠的含有PrP的尿液样本。对于接种，尿液样本的制备如上文所述（包括PK的溶解，但是不在SDS进行煮沸），按照要求在1%BSA/PBS进行稀释。来自于感染痒病的鼠类脑部样本进行稀释，抑制与PrP^Sc相似的浓度（见图3），对其他种群鼠类进行接种。为达到与在脑部和尿液的蛋白酶抗PrP的相似浓度，每个动物按照自己所属的实验组进行接种，使用来自0.5毫升尿液或1.25μl 10%患有痒病的鼠类脑部均匀混合物的50μl样本，样本中含有PrP。

鼠类尿液的收集

    接种后，动物需要每日进行痒病相关症状的检测。实验时间紧迫，在疾病潜伏期的3组鼠类在代谢笼子中一个星期，在第二天收集800-1500尿液。尿液在早晨进行收集，然后马上进行冷冻（-80℃）。食物和水随意供应。相同的过程适用于患有痒症的鼠类。

组织匀浆

全脑或肾脏都在10容积均化液中均匀化（10毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸盐pH值7.5， 300毫米蔗糖）。离心（2000rpm，15min，4℃）后，上层清夜被冷冻（-80℃）。

人类尿液样本

只要有可能，患有克雅二氏症患者的样本，质控物为首次晨尿。一些克雅二氏症患者和中风患者带有导尿管，在这些案例中，尿液收集袋中的尿液收集最长不超过8小时。所有的样本在进行深入研究前进行冷冻。

牛的尿液样本

    所有的疯牛病和大部分质控牛的尿液样本来自于伦敦的兽医实验机构（VLA）。该机构的样本包括24头母牛的51个样本，所有的编码都可进行盲测。额外的新鲜冷冻质控样本来自于希伯来大学兽医学院。根据该机构的记录，大部分样本在收集后马上进行冷冻，其中一些已保持冷冻状态。就当天收集样本的时间没有提供任何信息。

 

结论

在此项研究中的大部分克雅二氏症患者的测试是E200K突变的遗传患者。在这些患者中一位52岁的患者就是同型突变。在其他受遗传的患者中，有四个是在基码129，一个为MV。E200K突变在蛋氨酸129等位基因。人类的质控（15例），既有健康个体（7例），还有患有多种神经系统疾病的患者，例如阿兹海默氏症（3例），多发性硬化症（2例），中风（3例）。感染牛海绵状脑病牛的尿液，和其它大部分在研究中使用的牛质控物一样，来自于伦敦的兽医实验机构。对于这些牛的样本来说，就像盲测一样进行尿液检测。有痒症的鼠类尿液，无论是接种了263K prion菌株，还是正常的质控，都使用代谢笼子（如上述解释）进行收集，来自于这3种物种的沉淀。

来自于感染痒症的鼠类，患有克雅二氏症的患者，感染牛海绵状脑病的牛的尿液样本，就像其他适合的质控物，如研究方式中描述的UPrP^Sc的浓缩进行，随后对PrP缩氨酸进行免疫弱化。人类和鼠类的尿液样本，无论是mAb 3F4还是6H4（未显示），都要进行免疫弱化，但是牛样本只能用mAb 6H4进行弱化。相匹配的样本只使用二等α小鼠血清进行弱化，无任何干扰信号。

图一指出此项研究的结论。在影响人类和动物prion疾病的透析的尿液中发现沉淀的蛋白酶抗体PrP形式时，这个案例并不适合尿液的适当质控。PrP尿液化验，人类（15例）、鼠类（10例）（当每个样本代表3个鼠类的沉淀物）、牛（15例）是阴性，对所有进行测试的患有克雅二氏症的患者（8例），大部分鼠群（20例），10-12头患有牛海绵状脑症的牛是阳性的，但是其它两例患有牛海绵状脑症的阳性牛显示出阳性，但是并无不良征兆。正如图1c中显示的患有痒症鼠类的尿液中的蛋白酶抗UPrP^Sc的检测是必需的。事实是，在尿液中的PrP征兆被3F4缩氨酸阻断，不能与继发抗体进行反应，为这种征兆属于PrP缩氨酸提供有力证据（图1d）。

上述描述的结论让人很惊奇：蛋白酶敏感PrP同体在正常尿液样本的分馏物沉淀中存在，与我们希望的PrP^C相反。然而，值得注意的是，在使用超速离心法提取膜之前没有在尿液中加入清洗剂导致可溶解的PrP^C。由于尿素的存在，尿素能够促进蛋白质聚合，在个别变性情况下所有的PrP分子都在尿液中存在。同时正常尿液的分离可导致PrP^C的聚合，与UPrP^Sc相反其是蛋白酶敏感物。虽然UPrP^Sc准确的化学性质已确定，它的分子重量似乎比标准长度和标准糖化的PrP^C或PrP^Sc的稍微重些。除此之外，在免疫弱化中的UPrP^Sc模型显示出其由大量高分子PrP带组成，并不由少量的糖化种类组成。这可能指出个体或非糖化PrP在遭遇PrP^Sc时与这些条件不发生抵触，直到其在尿液中作为UPrP^Sc排泄。正常的PrP在尿液中排泄，这并不惊奇，直到其它相关GPI锚蛋白质出现问题。

因为在感染痒症鼠类的肾脏组织中无法辨认出PrP^Sc，UPrP^Sc不能直接由肾脏产生。这指出UPrP^Sc由其它器官产生，通过血液流动到达尿液。

在prion疾病的最终阶段检测PrP^Sc由通过脑部恶化中脑部血栓瓦解的血液程度产生。反之，在尿液感染prion疾病潜伏早期PrP^Sc的存在为无论来自于脑部还是来自于外部器官的异常PrP蛋白质提供清除方式，通过自身排泄到尿液中。为研究这个问题，我们在叙利亚鼠脑内或腹膜内接种鼠类prion，然后收集尿液样本，就如上述描述的方式，在每周的接种时间进行。在收集后每个样本立即进行冷冻。在实验的最后阶段，将与尿液样本的相似容积进行解冻，就如上述的为PK防腐剂UPrP^Sc进行浓缩，随后用αPrP mAb 3F4进行免疫弱化。

这个实验的结果可在图2中看到。Prion中具体PrP的轻微征兆在尿液样本中检测出来，在进行接种鼠类的17天后（图2a），随之直到第35天PrP征兆消失。然后，直到临床现象出现，蛋白酶防腐剂PrP征兆才提高。在接受接种的鼠类中得到相同的结论。在接种后的第一周便检测出PrP征兆，在接下来的日期其消失了，在大约60天时重新出现。从这些结论可以推断，一些prion接种体在接种后立即分泌。据此，直到脑部prion蛋白质积聚的第一阶段PrP征兆才在尿液中出现。确实，痒症潜伏期，接种263菌株的鼠类分别为75和120天，在40或70天的这些鼠类浓缩的脑部样本中可识别PrP^Sc。因此我们的实验指出UPrP^Sc在尿液中进行排泄与在脑部的积聚是同时进行的。

在图1和图2中所描述的实验结果指出蛋白酶防腐剂PrP的尿液检测不仅可用来在疾病的最终阶段在动物和人类中诊断prion疾病，还可以在感染的亚临床阶段诊断这些疾病。确实如果在感染后的第一周检测出PrP征兆，是由于接种体的肃清作用，PrP尿液测试诊断感染发生的潜在危险。在未来这是可以实现的，使提供有效的抗prion治疗成为可能，在prion发生初期就对个体进行治疗。

UPrP^Sc检测增加了令人担忧的可能性，来自于感染prion个体的尿液，无论是生病还是疾病潜伏期无论如何都能传播prion疾病。在患有牛海绵状脑病的牛中这种期望尤其令人烦恼，就像在患有痒症的羊类身上一样。这种机能从未说明，自从在兽群中的所有动物中传播这种疾病，尿液能够污染这些动物的生存环境，这是可以想象的。

为研究如果在感染遗传海绵状脑病动物尿液的感染性，我们用UPrP^Sc接种20个鼠类，浓缩10个患有痒症的鼠类的尿液。就像10个正常鼠类样本的准备，进行20个鼠类的接种。感染痒症鼠类的脑部样本，将其进行稀释，包含PrP^Sc相似的浓度（10%组织匀浆1.25μl）而不是浓缩的UPrP^Sc（来自于0.5毫升的尿液），在其他鼠类群中进行接种（图3a）。对感染痒症鼠类的症状每天进行观察。在接种UPrP^Sc的动物中定期收集尿液。在实验中的不同时间点，一些接种UPrP^Sc的鼠类不断死亡，对这些动物脑中存在的PrP^Sc进行检测。

正如我们希望的，接种感染痒症动物的脑样本在接种后大约80天患上致命的疾病。反之，到目前为止，没有任何接种尿液样本的动物（正常或感染痒症）没有发展成prion疾病的临床症状（270dpi）。检测12个鼠类（3个由4个鼠类组成的群）中UPrP^Sc的存在，在接种后大约60天发现其呈现阳性（图3b，2）。除此之外，在120天左右死亡的每3个小鼠中就有一个小鼠的脑中可确定低浓度PrP^Sc（图3b，3）。在此项实验中的其他鼠类仍在观察中，以便在以后的日子中确定它们是否发展成为致命的prion疾病。这些结论显示出接种UPrP^Sc可导致亚临床状态或感染prion的障碍阶段。这个发现的临床和流行病学结论需要进一步的证实。

 

讨论

为什么UPrP^Sc排泄到尿液中？因为大部分尿蛋白在血液中产生，我们推测一些PrP^Sc，无论其来自大脑还是来自于外部器官，在非聚合体中PrP^Sc由潜伏期扩散到血清，虽然其浓度很低，无法检测到。由于蛋白酶防腐剂，这种PrP^Sc无法通过血液蛋白酶溶解。然而，通过肾脏细胞，由于PrP的MW值低于过滤的分离点（大约40kDA），随之PrP可能分泌到尿液中，然后被浓缩，就像其他蛋白质，在血液中是其原来浓度的120倍。通过肾脏的浓度，在尿液中比在血液中检测PrP^Sc更容易，使其成为可能。由于尿液的分离在我们的检测过程中是必要的程序，我们建议：UPrP^Sc存在于变异形态中，可能是由于尿液变性器官的相对高浓度，还有在分离阶段随之产生的复原。这种变性/复原效应，由于土壤吸收尿素也可能在土壤中发生。

UPrP^Sc在脑部PrP^Sc中的构造不同，因此可解释这种现象，接种相同数量的蛋白酶防腐剂PrP同体可产生不同结论。然而值得提出的是，不是所有的蛋白酶防腐剂PrP分子携带prion传染性。事实上，体内PrP^C转化为PrP^Sc的实验，在此项实验中蛋白酶防腐剂通过变性/复原过程产生，这项实验产生蛋白酶防腐剂但是没有具有传染性的PrP同体。反之，UPrP^Sc可能类似于我们在稍后确定的新蛋白酶防腐剂可溶同体，如果可能的话此类物质与低传染性相关联。最新的可能性与此事实相关：由于在肾脏中不能过滤沉积的分子，UPrP^Sc存在于尿液中。

同样，可以推断：UPrP^Sc是新prion变种的组成部分，比最初263K菌种的传染性小，其不会产生致命疾病，但是会出现prion疾病的亚临床症状或障碍阶段。最近的出版物指出，动物脑部的低等级PrP^Sc，不会屈服于prion疾病，这表明prion疾病的亚临床状态是存在的。在某些案例中，这些动物的脑部对其它啮齿动物传播致命性prion疾病，这表明很明显prions疾病的健康带菌者可传播疾病。

总结，我们已确认感染prion动物和人类尿液中的prion蛋白酶防腐剂PrP同体（UPrP^Sc），可用在看似健康但是感染prion个体的体内早期疾病诊断中。除了这些实验中的要素，我们发现，在prion感染和疾病中，这项研究可为新陈代谢和PrP^Sc代谢物清除的研究开辟一条新的道路。

 

致谢

我们感谢Hadassah医院神经科Abramsky教授，Barzilai医院神经科Kahana教授。Barzilai医院神经科类似于以色列神经研究共同体，在提供克雅二氏症患者样本和有效的意见方面进行联合。我们非常感谢伦敦的VLA实验室为我们提供来自于正常或患有牛海绵状脑病的牛的样本，同时感谢希伯莱大学兽医学院为我们提供正常牛的尿液。

 

图例

图1：患有遗传性海绵状脑病的人类和动物尿液中的蛋白酶防腐剂PrP。

a．鼠类、人类和牛的新鲜冷冻过的尿液样本，正如上述方式进行浓缩得到蛋白酶防腐剂PrP。如上所描述的方式，所有的样本在蛋白酶K存在或缺失的情况下溶解，使用αPrP mAb 3F4（鼠类和人类样本）或6H4（牛样本）进行免疫弱化。（1）同型E200K克雅二氏症患者（2）杂合E200K克雅二氏症患者（3）人类质控物（4）患痒症的鼠类（5）正常鼠类（6）患牛海绵状脑病的牛（7）正常牛。按照描述的方式使用尿液的容量。

b.对5μl 10%脑部样本进行PrP分析（1）同型E200K克雅二氏症患者（2）杂合E200K克雅二氏症患者（3）人类质控物（4）患痒症的鼠类（5）正常鼠类（6）患痒症鼠类的肾脏样本

c.在透析过程中或透析过程外浓缩患有痒症鼠类尿液得到UPrP^Sc。按照以上描述的方式在存在或缺失PK的情况下样本被溶解。

d.人类脑部样本（b）和人类尿液样本（U）使用存在或缺失由10μg/ml缩氨酸组成的3F4抗原决定基中的mAb 3F4进行免疫弱化。分子重量生物标志物（高-低）；36 kDa，30 kDa。

图2：Prion种PrP在接种痒症期间可被检测到。

无论接种鼠类263K prions的（a）或（b），每周对叙利亚鼠进行尿液样本收集，如描述进行浓缩得到UPrP^Sc。样本用αPrP mAb 3F4进行免疫弱化。图中的箭头代表临床现象的出现。分子重量生物标记物；30 kDa。

图3：I.C接种UPrP^Sc的叙利亚鼠类。

在叙利亚鼠类中接种来自感染痒症的鼠类脑部或尿液的等量PK防腐剂PrP。所有的样本用1:5000 mAb 3F4进行免疫弱化。

（a）PK防腐剂PrP^Sc等量物来自于5μl 10%的鼠类脑部匀浆（1），与2毫升患有痒症鼠类尿液进行比较（2）。

（b）（1）感染痒症鼠类的脑部样本（2）从接种UPrP^Sc鼠类收集（60 dpi）的尿液样本（3）接种UPrP^Sc的一个动物的脑部样本。所有的样本在缺失或存在PK的情况下溶解。分子重量生物标记物（高-低）；36 kDa，30 kDa。

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