实时定量PCR技术综述

一．基本原理
1.PCR反应动力学
右图为PCR反应曲线（横坐标为循环数，纵坐标表征产物量），不同的曲线代表初始模板量不同的 PCR反应。PCR反应的动力学公式为：
C_n=C₀(1+E)ⁿ
其中C₀和C_n分别为初始模板和n循环的拷贝数，n为循环数，E为扩增效率（0≤E≤1），理想状态下（即每个循环中所有模板均与引物结合并等到扩增），E为1。

 

由上图可知，只有在线性区段E值才为定值，这样才能通过检测C_n定量C₀，由于终点检测不能保证在线性区段，所以重复性不好，实时检测（每个循环检测一次）技术解决了这个问题。
2.定量PCR原理

定量PCR是将待测标本与一系列浓度（C₀）已知的标准品在同一条件下共同扩增，并进行实时检测，根据标准品的检测值及已知的C₀值作出标准曲线，如右图（横作标为的C₀对数值），再根据待测标本的检测值在标准曲线上查到待测标本的C₀值。
3.信号产生
目前定量PCR技术信号产生都是基于FRET (fluorescence resonance energy transfer)的原理，即在一定波长的光激发下，一个荧光基团A发光，并且被邻近的另一个荧光基团B吸收，使荧光基团B发光。如检测荧光基团A，应在FRET消除后；如检测B，则应在FRET发生时检测。
根据信号产生方式的不同可将定量PCR技术分为三类：TaqMan Probes技术；Hybridization Probes技术；Molecular Beacons技术。
TaqMan Probes技术（下图）是Perkin  Elmer公司1995年研制，利用热稳定DNA聚合酶5’→3’外切

 

酶活性，将TaqMan 探针5’端荧光基团切去，使之与3’端荧光基团分离、荧光淬灭消失，在特定波长下检测5’端荧光基团即可表征PCR产物的量。

Hybridization Probes技术（右图B）是Roche公司建立的，PCR反应退火过程中，两个探针与模板杂交（相邻一个碱基），发生FRET，这时检测第二个荧光基团即可表征PCR产物的量。Hybridization Probes技术要求热稳定DNA聚合酶不具备5’→3’外切酶活性，而是在引物延伸过程中被取代，使探针可在下一循环再与模板杂交，如探针被降解，可导致定量不准。

Molecular Beacons技术（上图C）利用茎环结构的探针，当形成茎环结构时，发生荧光淬灭，退火过程中，探针与模板杂交，荧光淬灭消失，在特定波长下检测5’端荧光基团即可表征PCR产物的量。

二.荧光标记
1.TaqMan Probes
TaqMan探针通常在5’端以荧光基团FAM标记，靠近3’端以荧光基团TAMRA标记，3’端磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。下表列出了两种荧光基团的吸收及发射波长。

	FAM	TAMRA
吸收波长	492	547
发射波长	518	573

2.Hybridization Probes
Hybridization探针技术中，上游donor Probe 3’端以荧光基团Fluorescein标记；下游acceptor Probe 5’端以Roche的LC-Red 640标记（当用双荧光基团时还可同时使用LC-Red 705），3’端磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。也有文献报道acceptor Probe 5’端以Cy5标记，下表列出了各种荧光基团的吸收及发射波长。

	Fluorescein	LC-Red 640	LC-Red 705	Cy5
吸收波长	494	625	685	643
发射波长	519	640	705	667

3.荧光标记基团与PCR仪的激发与检测波长
由于荧光标记基团的选择还受到定量PCR仪所提供的激发和检测波长的制约，所以这里介绍一下临床应用中主流机型所提供的检测波长，见下表。

	GeneAmp 5700SDS	ABI Prism7700(适用于科研)	LightCycler
检测波长	530nm	500-660nm	530nm;640nm;705nm

三.TaqMan Probes技术要点
TaqMan Probes技术要求所用的热稳定DNA聚合酶不但要具有5’→ 3’外切酶活性,而且要求所获得的扩增曲线符合PCR反应动力学。
Matthew J.Longley等（1990）研究了热稳定DNA聚合酶的5’→3’外切酶活性,认为：（１）其5’→3’外切酶活性和DNA聚合酶活性位于同一肽段；（２）5’→3’外切酶活性依赖于双链DNA（如下图）；

（３）5’→3’外切酶活性具有热稳定性，之所以70℃较50℃活性低（如右图）是由于高温破坏了探针与模板间的双链结构。
K-A.Kreuzer等（2000）研究了15种热稳定DNA聚合酶（商品）的5’→3’外切酶活性，其中7种声称具有5’→3’外切酶活性，右图是这７种酶的定量PCR反应（TaqMan）曲线,其中部分酶没有5’→3’外切酶活性、部分酶具有较弱的5’→3’外切酶活性、只有一种酶的扩增曲线（A）符合PCR反应动力学。

下表列出了部分文献报道的TaqMan Probes技术所使用的酶和其它相关参数。

Target	P1	P2	Probe	Enzyme	退火温度	延伸温度
HCV	19	25	27	AmpliTaq DNA polymerase	60℃	60℃
HIV	19	22	32	AmpliTaq Gold polymerase(Perkin-Elmer)	60℃	60℃
Albumin	22	22	26	AmpliTaq Gold polymerase(Perkin-Elmer)	65℃	65℃
16S rRNA	27	26	28	Taq DNA polymerase	62℃	62℃
gB gene	18	18	27	AmpliTaq Gold polymerase (Perkin-Elmer)	58℃	58℃
omlA	22	22	21	AmpliTaq Gold polymerase (Perkin-Elmer)	62℃	62℃
lytA	21	21	25	Taq DNA polymerase	60℃	60℃

四.Hybridization Probes技术要点
Hybridization探针技术要求所用的热稳定DNA聚合酶没有5’→3’外切酶活性,以保证探针有恒定的浓度并能反复与模板杂交。
Jochen,Wilhelm等（2001）研究了Taq酶5’→3’外切酶活性对基于Hybridization探针技术的定量PCR的影响，认为：（１）Taq酶5’→3’外切酶活性降解了部分探针；（２）Taq酶的stoffel片段（去除N端289个氨基酸）不具有5’→3’外切酶活性，其在高浓度Mg²⁺存在下，能获得较好的PCR动力学曲线（如下图）；（３）stoffel片段因高Mg²⁺浓度造成的非特异性扩增可采用加入TaqStart antibody的方式消除。

五.TaqMan探针与Hybridization探针技术的比较
1. Hybridization探针技术的特异性高于TaqMan探针，因其信号的产生依赖于两个独立探针的特异性。但其在探针设计上需要更多的可选序列；
2. TaqMan探针技术的开放性优于Hybridization探针技术，原因有二：（１）TaqMan探针技术的荧光标记系统是开放的，易从第三方获得，而Hybridization探针的荧光染料为罗氏专有，易受其控制；（２）TaqMan探针和Hybridization探针分别在ABI Prism7700和罗氏LightCycler上建立，因荧光标记和仪器检测波长的不同，限制了其在两种仪器上的通用性，目前已有文献报道将TaqMan探针用在LightCycler上，但未见报道Hybridization探针用在ABI Prism7700上，可能是ABI Prism7700价格较贵，不适合临床应用，而ABI GeneAmp 5700SDS只有一个检测波长（530nm）；也可能Hybridization探针依赖于LightCycler的快速扩增。
3. Hybridization探针分别标记两个探针，和TaqMan探针的同一探针三种修饰相比，修饰技术要求低，对修饰的质量控制更有利。

 

 

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