生物芯片分类及其技术原理(二)

摘要：生物芯片技术针对DNA、RNA、蛋白质及其它生物分子，在芯片上完成一个或多个功能的检测分析，使大量与生命有关的信息集中在一块芯片上，达到对生物分子、细胞、组织的高通量检测分析。本文根据生物芯片的结构与功能特点，将生物芯片分为微点阵(阵列)芯片、微流路芯片两大类，每大类中又进行了较详细地分门别类，同时扼要介绍各自的技术原理。目前生物芯片技术正向着更加微型化和集成化方向发展，芯片实验室代表着更高的发展阶段。

关键词：生物芯片；微点阵；阵列；微流路

中图分类号：Q7 文献标识码：A 文章编号：1005—5673{2002}一03—0101—07

2 微流路芯片
    微流路(Microfluidic)芯片的共同特点是采用半导体微加工技术和(或)微电子工艺在芯片上构建微流路系统(由储液池、微反应室、微通道、微电极、微电路中的一种或几种组成)，加载生物样品和反应液后，在压力泵或电场的作用下形成微流路，于芯片上进行一种或连续多种的反应，达到对样品的高通量快速分析的目的。此类芯片的发展极大地拓宽了生物芯片的内涵。
2．1 流过式芯片
    常规DNA微点阵(阵列)芯片上DNA探针与靶核酸是被动作用的，受分子扩散的限制。流过式(Flow—thru)芯片的基本原理是将特定DNA探针结合于芯片微通道内的特定部位，荧光标记靶核酸由压力泵或电场驱动流过微通道，被互补探针捕获进行反应，达到对靶核酸的检测分析目的 ，探针和靶分子的作用是主动式的，因而大大增强了敏感性，提高了反应速率。
    Fan等在玻片上蚀刻了8条微通道，上方再覆盖一层玻片形成封闭通道。靶DNA分子通过亲和素．生物素连接于磁珠上，靶DNA．磁珠复合物被置于微通道中央，相应位置芯片上方置以磁铁使磁珠成为固定支持物，荧光探针加于微通道入口处，与芯片相连的气泵装置驱动探针进入微通道，探针分子与互补靶DNA 杂交。检测杂交信号完毕后，置于芯片下方的加热器的热变性作用使得探针分子脱离靶DNA。该芯片每次可进行8个靶DNA样品的检测分析，且热变性作用后洗去原来探针分子，靶DNA-磁珠复合物可以重复多次与不同探针样品进行杂交分析。
2．2 微电子芯片
    微电子(Microelectronic)芯片又称生物电子(Bioelectronic)芯片，分基于介电电泳原理和基于核酸主动杂交原理两类。基于核酸主动杂交原理的微电子芯片表面构建由许多微电极，微电极间由微电路相连，通过对微电极的电位控制，在微电极上方的检测位点完成DNA探针的选择性固着、靶核酸定向转移集中并与探针主动杂交、未杂交和错配杂交序列的选择性去除等过程，应用于核酸分子的杂交检测分析 。芯片表面的微电极阵列通常有5×5、10×10、20×20、100
×100排列四种；前两者为一类，芯片四周边缘还排列有一圈外突的连接电极(Contact dec． trode)，直径为160μm，芯片中央区域为检测电极(Test electrode)阵列区，检测电极直径为80 m，检测电极分别由微电路与连接电极相连，微电路表面由电介质(SiO2或SiN4)绝缘化，连接电极通过卡套装置于与电子控制系统相连，后者对各个微电极进行电位(极性、电流、电压)控制；后两者为另一类，芯片上没有连接电极，检测电极大小分别为50／μm 和30／μm，芯片上同时具有CMOS，CMOS通过卡套与电子控制系统相连后，CMOS的半导体元件对各个检测电极进行电位控制。基于介电电泳原理的微电子芯片应用于细胞或粒子的分离，有两维结构和三维结构之分。两维结构芯片的构造与基于核酸主动杂交原理的微电子芯片相类同，通过对微电极的电位控制，在芯片上形成介电电泳场，细胞或粒子混合样品中的不同成分转移集中于芯片上的不同区域得以分离。三维结构芯片的特点是芯片上蚀刻有微通道系统，微通道内构建有许多漏斗形、梳齿形、笼形、开关形三维电极元件，通过对电极的电位控制形成介电电泳场，同时利用三维电极的物理构造达到对细胞或粒子混合样品中各个成分的转移、聚集、捕获、分离。
2．3 PCR芯片
    1996年Wilding等首次开发制作了PCR芯片，在17×15mm大小的硅片上分别蚀刻了可容纳5．0μ l和l0μl样品溶液的反应池，将芯片置于一个由计算机控制的热循环仪中控制PCR反应的进行、Shoffner等以玻片覆盖反应池形成反应室，由于反应室内具有较高的比表面积，有利于PCR反应的进行；反应室内天然表面对PCR反应有抑制作用，SiN4表面也有一定的阻碍作用，Si02表面则可达到Eppendorf管中PCR同样的反应效率，Cheng等针对此类芯片摸索出了两套高效扩增体系。Kopp等制作了连续流式PCR芯片，在一张玻片上蚀刻了多次折回的梳齿状微通道系统，微通道内表面硅烷化，覆盖一层玻片形成封闭的反应系统，玻片下方置有三块恒温铜块作为热源，将微通道系统分成三个温度区，当PCR反应混合物流经不同的温度区时，自动变温，在流动中进行变性、退火、链延伸等反应步骤。有关芯片PCR技术及其应用的其它研究报道可以从KrickaJ的综述中查阅。
2．4 毛细管电泳芯片
    常规毛细管电泳是指在内径25～ 100μm的石英毛细管中进行的电泳，毛细管中填充了缓冲液或凝胶。毛细管电泳芯片技术是指在芯片上蚀刻毛细管通道，在电渗流的作用下样品液在毛细管通道中泳动，完成对样品的检测分析；如果在芯片上构建毛细管阵列，可在数分钟内完成对数百种样品的高通量平行分析。
    早在1990年Manz等就在一块玻片上蚀刻了一条毛细管通道进行了芯片上毛细管电泳。而Woolley等于1994年制成了首张毛细管电泳阵列芯片，在玻片上蚀刻了宽30～70ttm 的毛细管阵列，上方再覆盖一层玻片形成封闭泳道，泳道内表面加入羟乙基纤维基质，对 X174HaeIIIDNA限制性内切酶片段进行了毛细管筛分电泳分析。近年来发表了大量有关毛细管电泳芯片的研究
报道，并已有多篇文献综述。按样品分离模式，芯片上毛细管电泳有毛细管区带电泳(Capillary
zone electrophoresis)、毛细管筛分电泳(Capillary sieving electrophoresis)、毛细管等电聚焦(Capillary isoelectric focusing)、毛细管微团电动色谱(Capillary micellar electrokinetic chromatography)等，囊括了毛细管电泳的全部种类。在核酸研究领域，毛细管芯片主要应用于核酸序列长度测定、基因分型、DNA测序、集成核酸样品制备与分析；在蛋白质研究领域，主要应用于蛋白质分子量测定，蛋白质样品分离、免疫分析、酶分析；毛细管电泳芯片还应用于氨基酸、维生素、糖类、药物、除草剂等生物分子的研究。
2．5 毛细管层析芯片
    早在1979年Terry等就在一块硅片上完成了样品的气相色谱分析L4 ，但之后没有进一步进展。随后又有一些液相色谱芯片的研究报道，但与芯片上毛细管电泳技术相比，芯片上毛细管层析技术明显落后。
    在芯片上毛细管通道两端构建电极，加以电压，以电渗流(Electrosmotic flow，EOP)驱动样品液泳动，即实现了芯片上毛细管电泳。而常规液相色谱是通过压力泵形成流体力驱动样品液，这在芯片上毛细管通道中实现起来很困难。当然，这可以同样采用电渗流驱动来解决，但这又带来了新的问题，即毛细管通道中层析基质不仅要提供与样品分子相互作用的位点，而且还要带有电荷以维持电渗流，后一功能显然是常规液相色谱中的层析基质所不具备的。
    Jacohson等将玻片毛细管通道内表面内经十八硅烷修饰，Regnier等在石英片毛细管通道内蚀刻出许多颗粒状突起，作为常规液相色谱中微粒基质的替代物、实现了芯片上电动毛细管液相色谱分析。
2．6 多功能集成芯片
    多功能集成芯片是指一类将前述多种功能集成在一块芯片上的微分析系统。W ilding等在一块硅片上蚀刻了容积4．5μl的PCR反应流通室，在流通室内的通道中制作了一系列3．5μl大小的堤坝型(Weir-type)过滤结构，从而制成了细胞过滤PCR集成芯片，在芯片上连续完成了从全血样品中分离血细胞和对肌营养不良蛋白基因的PCR扩增，将两个不同的分析功能集成到一块芯片上。
    Watem等将PCR反应室和电泳分析微通道制作于一块芯片上，上方再覆盖一层玻片，形成封闭反应体系，微通道体系的入口处有一个15μl或70μl容积的进样口，该芯片可一次进行4个DNA样品的PCR扩增和扩增产物电泳分析。Waters等采用同样方法将细胞破碎、PCR 扩增、电泳分析三种功能集成于一块芯片上。
    Burns等制作了一种大小为47mm×5mm×lmm 的集成纳升级DNA分析芯片，该芯片由一个纳升级液体进样器、一个样品混合器、一个定位系统、一个可控温的反应室、一个电泳分离系统、一个荧光检测系统组成。这些微通道系统均通过标准微加工技术由一片玻片和硅片组成，芯片外置了激发光源、压力源和控制电路，当加入DNA样品和反应试剂后，DNA序列分析结果即以电子信号的形式给出。
    在上述早期研究的基础上，又陆续发表了一些集成生物芯片的研究报道。其中引人注目的AnderSOn等和Gottschlich等的研究报道，前者的芯片集成了细胞裂解、RNA提取纯化、逆转录
PCR、套式PCR、DNA酶消化、DNA片段脱磷酸化、末端转移酶催化标记、靶DNA与探针点阵杂交、信号检测等多种功能，可进行自动化的HIV 基因分型，后者是一个集成的蛋白质分析芯片，可在芯片上连续进行酶促反应、反应产物电泳分离、分离后各组分的标记、信号检测等过程。但基于芯片的集成微分析系统仍处于发展的早期。