福建医科大学附属协和医院(350001) 陈建森 郑华卓光生 曾德成
【摘 要】 目的 用荧光定量聚合酶链反应（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)方法定量检测血清中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的数量及探讨其与HBV标志物(HBV M)表现模式的关系，以指导临床。方法 共244份临床血清标本，HBV DNA定量采用荧光定量PCR分析系统，HBV M采用ELISA法。结果 经FQ-PCR检测，99例HBsAg（＋）／HBeAg（＋）／HBcAb（＋）的标本，其血清标本HBV DNA亦全部阳性，平均HBV DNA拷贝数为1.82×107copies／ml；96例HBsAg（＋）／HBeAb（＋）／HBcAb（＋）的标本，其HBV DNA检出率为66.7%(64例)，平均拷贝数为1.82×104copies／ml；11例HBsAg（＋）／HBcAb（＋）的标本其HBV DNA检出率为63.6%(7例)，平均拷贝数为7.94×104copies／ml。结论 血清HBV DNA水平与HBV M表现模式有关，HBsAg（＋）／HBeAg（＋）／HBcAb（＋）的标本HBV DHA值显著高于HBsAg（＋）／HBeAb（＋）／HBcAb（＋）的标本和HBsAg（＋）／HBcAb（＋）的标本，提示HBsAg与HBeAg的存在影响HBV DNA水平。FQ-PCR能实现准确定量，可以检测HBV的真实感染和复制情况，对于乙型肝炎的临床诊断、治疗方案的选择和疗效考察有较大的指导意义。【关键词】 肝炎病毒，乙型；DNA，肝炎病毒，乙型；定量 PCR
Compare the relationship between hepatitis B virus DNA detected by
fluorescence quantitative PCR and hepatitis B virus markers
Chen Jian Sen,Zheng Hua Shen,Zeng De Cheng.
Union Hospital,Fujian Medical University，Fuzhou 350001，China
各HBV M表现模式及FQ-PCR检测其HBV DNA定量结果
【Abstract】 Objective To explore the relationship between hepatitis B virus DNA and hepatitis B virus markers．Methods 244 clinical serum samples were collected．Hepatitis B virus DNA was detected by FQ-PCR and hepatitis B virus markers were detected by ELISA．Results In 99 HBsAg（＋）／HBeAg（＋）／HBcAb（＋）samples，FQ-PCR results were positive，with 1.82×107 copies／ml of HBV DNA average．In 96 HBsAg（＋）／HBeAb（＋）／HBcAb（＋）samples，the average was 1.82×104 copies／ml with a positive rate of 66.4％．In 11 HBsAg（＋）／HBcAb（＋）samples，the average was 7.94×104 copies／ml with a positive rate of 63.6％．Conclusions There is a significant correlation between HBV markers and HBV DNA．The HBsAg（＋）／HBeAg（＋）／HBcAb（＋）samples were significantly higher than the HBsAg（＋）／HBeAb（＋）／HBcAb（＋）samples and the HBsAg（＋）／HBcAb（＋）samples．FQ-PCR can be used to monitor the true state of HBV infection and amplification．
【Key words】 Hepatitis virus，B；DNA，hepatitis virus,B；Quantitative PCR
乙型肝炎病毒感染是影响我国人民健康最重要的传染病之一，现我国约有1.2亿人口为HBV携带者［1］，乙型肝炎病毒感染所致的慢性乙型肝炎病程迁延，有进一步发展为肝硬化或肝功能衰竭的可能，甚至于发展成肝癌，因此对HBV的检测是较为关注的课题。我们采用荧光定量聚合酶链反应方法检测了244份临床血清标本，并同时采用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunoasorbent assay，ELISA）进行对照检测，报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源：244份临床血清标本来自2001年11月～2002年5月到我科作乙型肝炎血清标志检测者标本，根据其HBV M表现模式分为9组。所有标本均为随机抽样。
1.1.2 仪器：德国罗氏公司LightCycler荧光定量PCR仪。
1.1.3 HBV DNA定量检测试剂盒：深圳匹基生物工程技术股份有限公司出品。
1.1.4 HBV ELISA检测试剂盒：厦门新创生物工程有限公司出品。
1.2 方法
1.2.1 HBV DNA定量检测：采用德国罗氏公司LightCycler荧光定量PCR仪及深圳匹基生物工程股份有限公司生产的HBV DNA荧光定量检测试剂盒进行HBV DNA定量检测，严格按照仪器及试剂盒说明书操作。
1.2.2 HBV M检测：采用ELISA方法检测，严格按照试剂盒说明书操作。
1.2.3 定量结果统计方法：定量结果采用求对数平均值的方法计算HBV DNA的平均拷贝数，遇有阴性结果，不参与平均值的统计。统计学方法采用配对t检验。
2 结果
2.1 FQ-PCR检测HBV DNA定量结果：见表1。
表1
| 模式 | HBV M表现模式 | 例数 | 阳性
数 |
阳性率
(%) |
平均HBV DNA
(copies／ml) |
平均HBV DNA对数
（lg copies／ml) | ||||
| HBsAg | HBsAb | HBeAg | HBeAb | HBcAb | ||||||
| 1 | + | - | + | - | + | 99 | 99 | 100 | 1.82×107 | 7.26±1.24 |
| 2 | + | - | - | + | + | 96 | 64 | 66.7 | 1.82×104 | 4.26±1.51 |
| 3 | + | - | - | - | + | 11 | 7 | 63.6 | 7.94×104 | 4.90±1.69 |
| 4 | - | + | - | - | - | 3 | 0 | 0 | … | … |
| 5 | - | - | - | - | + | 2 | 0 | 0 | … | … |
| 6 | - | + | - | - | + | 14 | 1 | 2.1 | 2.14×104 | 4.33 |
| 7 | - | + | - | + | + | 9 | 0 | 0 | ||
| 8 | - | - | - | + | + | 2 | 1 | 50 | 9.12×102 | 2.96 |
| 9 | - | - | - | - | - | 8 | 0 | 0 | … | … |
| 注：遇有阴性结果，不参与平均值的统计 2.2 常见HBV M表现模式其HBV DNA检测结果的比较，见表2。 表2 HBV标志物不同模式HBV DNA检测结果
|
| 模式 | P值 | |
| 与1组相比 | 与2组相比 | |
| 1 | … | … |
| 2 | P＜0.01 | … |
| 3 | P＜0.01 | P＜0.05 |
3 讨论 聚合酶链反应(PCR)可对特定基因进行扩增，因此被广泛应用于获取特定基因或基因片段及临床基因诊断等领域。普通PCR应用于基因诊断有许多局限性，主要一是不能准确定量，二是由于太灵敏，容易交叉污染，产生假阳性。为了克服上述不足，人们采取了许多方法，但均不很成功，直到最近荧光能量传递技术（fluorescence resonance energy transfer，FRET）应用于PCR定量后上述问题才得到较好的解决。FRET是指通过供受体发色团之间偶极-偶极相互作用，能量从供体发色团转移至受体发色团，转移效率与两个发色团之间距离的6次幂成比例［2］。荧光定量聚合酶链反应是检测乙型肝炎病毒量，其检测原理：采用LightCycler技术，它是Roche公司新近开发的一种PCR定量技术，该技术的特点是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，产生发光探针和淬灭探针，发光探针的5′端连接荧光分子，淬灭探针的3′端连接荧光分子。由于两探针设计时可与模板同一链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光分子和淬灭分子便紧密相邻，从而发生FRET而使荧光淬灭。荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此可以进行PCR定量分析。而作为临床诊断HBV感染的传统方法的ELISA，则实际上仅仅检测的是人体对HBV的免疫反应状态。 通过采用荧光定量聚合酶链反应检测，我们可以发现1组与2组(P＜0.01)，及1组与3组(P＜0.01)，2组与3组(P＜0.05)相比有显著性差异，从而可知HBV DNA的水平与HBeAg的存在有显著的关系，与HBsAg的存在也有明显的关系，说明HBeAg和HBsAg的存在一定程度上能反应HBV的复制程度。5组HBcAb单一阳性的标本其HBV DNA定量检测值虽然为阴性，但国内外学者证明［3～5］，单纯HBcAb阳性者中，在排除假阳性后，确存部分为HBV低水平复制，而因为本实验所收集的相关标本少，可能影响结果的真实性。6组也检测出HBV DNA，提示血中存在中等水平的HBV复制，说明未检出HBsAg，有HBsAb、HBcAb的出现并不能全部提示是既往HBV感染。8组中在HBeAb、HBcAb的存在下也可检测出HBV DNA，可说明HBeAb的出现也不能表示HBV复制的停止。HBV M各种表现形式均可能存在不同程度的HBV复制，但因时间短，有些表现形式(如：单一HBsAg阳性和单一HBcAb阳性)标本收集得不够多，从而可能导致有些表现模式的检出率低。 HBV DNA的定量检测在抗病毒治疗方法及疗效评价等方面也具有很大的应用价值。慢性乙型肝炎目前较好的治疗药物首推干扰素和拉米夫定，研究表明，血清中HBV的数量与干扰素的疗效有一定相关性，治疗前HBV DNA＜100pg／ml者中50%有效，而＞200pg／ml者中只有7%有效。HBV DNA定量检测在决定是否继续用拉米夫定治疗上也十分有用，它对拉米夫定有应答的病人在3个月的治疗后保持HBV DNA阳性的几率很低。临床上一般认为HBV DNA＜105拷贝/ml为完全应答；部分应答为未达完全应答标准但定量下降大于2个对数级；无应答为未达上述标准。 FQ-PCR能实现准确实时定量，可以检测HBV的真实感染和复制情况，对于乙型肝炎的临床诊治、治疗方案的选择和疗效考察有较大的指导意义。 参 考 文 献 1.刘厚钰．慢性肝炎．见，叶任高主编．内科学．北京：人民卫生出版社，2001，453～456．2.王小红．荧光定量PCR技术研究进展．国外医学分子生物学分册，2001，23(1)：42～45. 3．Kaneko S，Miller R H，Di Bisceglie A M，et al．Detection of hepatitis B virus DNA in serum by polymerase chain reaction：application for clinical diagnosis．Gastroenterology，1990，99：799～804． 4.张树林．乙型肝炎血清标志意义再认识．国外医学流行病传染病分册，1993，2：57～61． 5.骆抗先，闵佳，何海荣，等．单一抗-HBc阳性个体的血清传染性和随访．肝脏病学杂志，1994，3；2(1)：5～7． |
