（中山大学基础医学院人体解剖学教研室，广州，广东 510080）
[摘要]目的 研究人肝癌细胞株Hep G2中的肿瘤相关基因MAGE-A3启动子区域的去甲基化状态，探讨其作为肝癌检测的肿瘤标志物的可行性。方法 利用亚硫酸盐修饰后基因组测序的方法（BSP）分析肝癌细胞株Hep G2和正常对照基因组中MAGE-A3基因启动子区CpG岛甲基化/去甲基化状态，寻找肝癌细胞MAGE-A3启动子区CpG岛去甲基化位点。结果 发现MAGE-A3基因启动区域CpG岛甲基化状态在肝癌细胞株和人类正常基因组中的不同，寻找肝癌细胞株HepG2的基因组特异去甲基化位点 结论 通过对MAGE-A3启动子区CpG岛去甲基化位点的检测，可能用来进行肝癌的早期诊断。
[关键词] 癌； 肝细胞； 去甲基化； MAGE-A3
The 5’CpG island methylation patterns of cancer-testis antigen(CT-antigen)gene family-MAGE-A3 in the hepatocelluar carcinoma(HCC) cell lines - Hep G2
DING Xiao-hua,HE Yun-shao,QIU geng,YE songshan, YANG xiaofei,XU Jie,ZHANG taisong
(Department of Anatomy ,Zhongshan Mdeical College,SUN Yat-sen University,Guangzhou 510080,china )
[Abstract] objectives the aim of the present study was to examine the 5’CpG island methylation patterns of cancer-testis antigen(CT-antigen)gene family-MAGE-A3 in the hepatocelluar carcinoma(HCC) cell lines - Hep G2,and to develop the DNA demethylation patterns as a novel tumor biomarker. Methods It was used that bisulfite – sequencing PCR(BSP)to analysis the methylation /demethylation status of CpG site among the promoter of MAGE-A3 in Hep G2 and control,from which to study demethylation sites of CpG islands. Results The results indicate that several CpG sites in MAGE-A3 promoters have different methylation patterns in HCC cell lines as compared to those in normal WBCs,from which to found specifical demethylation patterns of CpG island in the HCC cell lines-Hep G2. conclusion it may be used for earily diagnosis of HCC by detecting of specifical demethylation pattern of MAGE-A3 CpG islands.
[Key words] Carcinoma；hepatocellular；demethylation；MAGE-A3
原发性肝癌（hepatocellular carcinoma ,HCC）是一种常见的恶性肿瘤，死亡率在全球男性中占第3位，女性中占第5位。HCC也是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病隐匿，预后差。目前常用的HCC诊断血清标志物仍为甲胎蛋白（alpha-fetoprotein, AFP）,但不很理想，敏感性和特异性不是很高。同时，AFP是肝细胞癌微转移检测常用的标志物[1],但因不具有肝癌特异性,在肝炎和肝硬化患者外周血中存在假阳性。因此在临床上寻找能反映血循环种HCC细胞的标志物成为迫切需要解决的问题。
据报道[2]，黑色素瘤抗原家族(melanoma antigen family or MAGE family) 中MAGE-A3基因在肝癌组织中呈特异性高表达，而在非肝癌患者的单纯肝硬化和正常肝组织中不表达。提示MAGE-A3可以作为肝组织发生癌变的一种检测方法。为此，我们对MAGE-A3基因启动子区域的甲基化状态进行研究，以期建立一套用于肝癌早期诊断的方法。
1 材料与方法
1.1 主要材料及试剂
肝癌细胞株HepG2来自中山大学附属二院感染科。人类正常基因组来自健康人群血液中的白细胞（WBC）。DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；克隆载体PMD18-T Vector、琼脂糖购自大连宝生物工程有限公司；Taq DNA Polymerase、大肠杆菌DH5α和100bp DNA ladder marker D505A购自和康生物科技有限公司。
1.2 方 法
1.2.1 DNA的提取：人肝癌细胞株Hep G2和正常对照WBC两者基因组的抽提都用QIAamp DNA Blood Midi Kit（Qiagen），操作过程严格按说明书所述。
1.2.2 DNA甲基化修饰：具体的实验原理和方法参照文献[3]中的相关内容。2.0ug基因组DNA稀释成45ul体积，加入新鲜配置的3M NaOH5ul，420C水浴20min。加入新鲜配制的亚硫酸氢钠（4.2M,pH5.0）520ul，氢醌（10mM）30ul，轻轻混匀。石蜡油封闭后，550C水浴16 h。DNA样本修饰结束后用Wizard Clean-up System（Promega）脱盐。纯化后的产物用180ul水进行冲洗。加入20ul 3M NaOH, 37度孵育15 min。然后加入无水乙醇和NH4OAc进行沉淀，最后用40ulTE融解DNA,并在-20度保存。 1.2.3 PCR引物：引物设计参照文献报道[4](由上海生物工程有限公司合成)。MAGE-A3 上游引物：5’-ATTTAGGTAGAATTTAGTTTTATTTTTGT-3’,下游引物：5‘-CATTAAACTCTATCCCCAAAATTCC-3’。PCR扩增反应在50μL体系中进行，包括：4μL修饰后的DNA模板；200 μmol/L dNTPs；每一条引物 100 nmol/L；3 mmol/L MgCl2；20mmol/L (NH4)2SO4；75 mmol/L Tris–HCl pH 8.3；3 U TaqDNA polymerase (MBI)。
扩增条件采用降落PCR：94℃ 预变性 4 min；94℃变性45s，退火温度从62℃到53℃降落，45 s, 72℃延伸45s, 每一退火温度，循环重复2次；再于退火温度52℃循环扩增重复40次；72℃延伸7min.扩增产物在含溴乙啶的1.7%琼脂糖上电泳。观察到阳性目的片段。
1.2.4 目的片段与PMD18-T 重组： 对PCR阳性扩增产物，按照QIAGENDNA凝胶回收试剂盒操作规程,回收纯化的MAGE-3目的片段,并与PMD18-T连接,转化感受态大肠杆菌DH5α。根据氨苄青霉素(Amp) 抗性试验，筛选出阳性克隆，通过PCR反应进行初步鉴定。
1.2.5测序及鉴定： 将阳性菌液送至上海生物工程有限公司进行单向测序。
2 结 果
3 讨 论
在表观遗传学（epigenesis）这个发展非常快的领域，DNA甲基化，组蛋白去乙酰化和ＲＮＡ介导是基因沉默（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）的三大主要原因。DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase ,DMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上去的过程[5]。高等真核细胞通常是对DNA分子上5‘-CpG-3’ 序列的胞嘧啶，进行甲基化修饰。5-甲基胞嘧啶占所有核苷酸碱基的0.75%－1%，大约70%－80%的5-甲基胞嘧啶存在于ＣｐＧ序列中，ＣｐＧ二核苷酸集中的区域称之为ＣｐＧ岛。 CpG岛一般为几百至一千碱基长，通常位于基因的5’端启动区，也可延伸至基因的外显子区[6]。许多研究显示，启动子CpG的高甲基化与基因的转录抑制有关[7]。与起动子相关的CpG岛的高甲基化能导致基因表达的丢失和基因的沉寂。
黑色素瘤抗原家族DNA编码序列位于X染色体长臂末端(Xq28)，由至少12个基因成员组成，它们只在肿瘤中表达，而在正常组织，除睾丸和胎盘外，均不表达[8,9,10] 。MAGE-A3在肝癌组织中的表达率是70%，在癌旁没有表达，且MAGE-A3的表达与平均年龄相关。这证明了检测的特异性[11]。还有文献报道MAGE-A3在肝硬变和正常肝活检组织中不表达，只有个别HCC癌旁组织标本可表达MAGE-A3 mRNA[2]。进一步说明MAGE-A3检测的特异性。
本章的研究是通过对基因组经亚硫酸盐修饰后直接测序（bisulfite-sequencing PCR, BSP）的方法研究MAGE-A3启动子区域的去甲基化状态。此方法由Frommer等[12]建立，随后Feil等[13]又对此法进行了改进。原理：单链DNA在HSO3-存在条件下，能有效地将C转变成U,而m5C可保持不变。随后对靶序列进行PCR扩增，紧接着再行PCR产物的克隆测序，这样所有的U和T残基均可被测定，而独有m5C残基象C一样被扩增，故该技术很容易确定个体基因组DNA分子中各个单链中单个C残基的甲基化状态，且每个m5C残基的确切位置也可通过阅读测序胶上相应的C带予以确定。由于HSO3-使DNA中的未甲基化的C→U,而甲基化的C则保持不变的这种甲基化与非甲基化的差异，其本质为单碱基变异。那么我们就可以通过BSP方法寻找一系列的突变碱基，建立一套检测MAGE-A3启动子区域点突变的方法，已其达到早期诊断肝癌的目的，以便对肝癌患者进行早期合理的治疗。由上述结果可以看出细胞株Hep G2和正常基因组DNA中MAGE-A3启动子区域的序列有多个碱基的变化，其实质也就是碱基的突变(C→T)。通过检测这些突变碱基以达到早期诊断肝癌的目的。当然从中我们还可以看到：①正常基因组DNA MAGE-A3启动子区域的序列中标有1和2的C和通过在线分析软件所得出的序列中标有1和2的T是不同的，其原因就是因为亚硫酸盐的修饰不完全所导致。②通过分析细胞株Hep G2 MAGE-A3、正常基因组DNA MAGE-A3启动子区域和通过在线分析软件分析MAGE-A3启动子区域的序列可得出，细胞株Hep G2 MAGE-A3启动子区域中的标有3的T后的A是测序的错误，其应该为G。因为在对基因组DNA进行亚硫酸盐修饰的技术有一些不足，如还存在着C→U不完全（如正常基因组DNA测序结果中标有1、2的C）、极少数m5C也可转化为T、CpG岛不变性和DNA部分降解以及PCR扩增的固有偏差[14]等诸多问题，但是该方法有简便可行、灵敏（≤ng）、准确（基因组测序和PCR方法分别可检出5%~10%和0.1%~1%的甲基化DNA）等优势[15]，故日益受到人们的高度关注并已得到广泛的应用。
当然本研究只是针对肝癌细胞株HepG2的MAGE-A3启动子区进行了探讨。由以上结果可以得到连一段序列的去甲基化位点，针对这些去甲基化位点我们可以涉及一系列的探针用于HCC的早期诊断。当然，如果这项技术真正应用到临床还有很长的路要走，还需要进一步的筛查并确定MAGE-A3启动子区域的甲基化图谱，针对其中具有普遍意义的去甲基化位点建立一套特异的检测方法。
参考文献
[1] Komeda T,Fukuda Y,Sando T,et al.Sensitive detection of circulating hepatocytes by alpha-fetoprotein mRNA in humans during liver surgery. Ann Surg 1997,226:43-50.
[2] 蔡胜利,赵海涛,冷希圣,等.黑色素瘤抗原-3基因在肝细胞癌中的研究.中华外科杂志,2000,38:693-696.
[3]HermanJG,GraffJR,MyohanenS,etal.Mythelation-specific PCR:a novel PCR assay for methyation status of CpG islands .Pro Natl Acad Sci USA.1996:93:9621-9826.
[4] Geng Qiu , Jiancheng Fang , Yunshao He . 5' CpG island methylation analysis identifies the MAGE-A1 and MAGE-A3 genes as potential markers of HCC. Clinical Biochemistry. 2006, 39 (3):259-266.
[5] 赵迎社,付步银. DNA甲基化在肿瘤形成中的作用(综述). 暨南大学学报(医学版).2001，22（4）：54-57.
[6] 耿玮，李晓明. 人原发性肝癌中多种基因CpG岛甲基化研究进展.消化外科，2005，4（4）：297-300.
[7]Bender,C.M.,Gonzalgo,M.L.和Gonzales,F.A.等.细胞分裂和基因转录在CpG岛甲基化中的作用.分子和细胞生物学, 1999.19（10）：6690-6698.
[8]DePlaenE,ArdenK,TraversariC,etal.Structure,chromosomal localization,and expression of 12 genes of the MAGE family.Immunogenetics,1994,40:360-369.
[9]TakahashiK,ShichijoS,NoguchiM,etal.IdentificationofMAGE-1and-4 proteinsins permatogonia and primary spermatocytes of testis.Cancer Res,1995,55:3478-3482.
[10]Itoh K,Hayashi A,Nakao M,etal.Human tumor rejection antigens MAGE.JBiochem,1996,119:385-390.
[11] 陈红松 覃柳亮 丛旭等.肿瘤特异性肿瘤睾丸抗原在肝癌组织中的表达.中华肝脏病杂志.2003，11（3）：145-148.
[12] Frommer M,McDonal LE,Millar DS,et al.A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:1827-1831.
[13] Feil R,Charlton J,Bird AP,et al.Methylation analysis on individual chromosomes:improved protocol for bisulphite genomic sequencing.Nuclei cacids Res,1994,22(4):695-696.
[14]Warnerke PJ,Joosten M,Vankan Y,et al.A rapid RT-PCR based method to islotate complementary DNA fragments flanking retrovirus integration sites.Nucleic Acids Res,1997,25(21):4422-4426.
[15] 周玉球，徐湘民.DNA甲基化分析技术的研究进展. 国外医学遗传学分册，2001，24（6）：303-308.
