陈梓榕 邱 耕 510080 广州 中山大学达安基因诊断中心
[摘要] 苯丙酮尿症是由于苯丙氨酸羟化酶基因突变引起的常染色体隐性遗传病。本文介绍了苯丙酮尿症及其分子诊断方法研究进展。 [关键词] 苯丙酮尿症； 苯丙氨酸羟化酶基因； 分子诊断
Advances in the Studies of Molecular Diagnosis of Phenylketonuria Chen Zirong, Qiu Geng Daan Gene Diagnostic centre,sun Yat-sen University,Guangzhou 510080， china
Abstract: Phenylketonria (PKU ) is one kind of autosomal recessive disease caused by phenylalanine hydroxylase(PAH ) gene mutation. This article reviews the Phenylketonria and the recent molecular diagnosis progress on the Phenylketonria.
Key words : phenylketonria (PKU ); phenylalanine hydroxylase(PAH ) gene; molecular diagnosis
苯丙酮尿症(phenylketonuria, PKU) 是一种氨基酸代谢异常的常染色体隐性遗传病。其中98%-99%是由于苯丙氨酸羟化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)基因突变导致肝脏苯丙氨酸羟化酶缺乏所致,1%-2%是由于苯丙氨酸羟化酶的辅酶四氢生物蝶呤缺乏,导致苯丙氨酸不能正常转化为酪氨酸,从而苯丙氨酸在体内异常蓄积并打破大脑氨基酸的平衡而致病。根据我国580多万新生儿筛查资料,我国PKU 发病率为1/11144[1]。按年出生人口2000万计算,我国每年约有1700例PKU 新病婴出生。患者按40年生存期计算，在社会上的PKU 病人可达33.2万之多,给社会和家庭带来沉重的精神和经济负担。但由于PKU是可治性的遗传病之一,早期诊断、早期治疗是其预后的关键,而分子诊断是实现早期诊断的有效手段。因此,近年国内外许多学者纷纷开展对PKU的分子诊断方法研究,本文主要对苯丙酮尿症及其分子诊断方法的研究进展进行综述。
1 苯丙氨酸羟化酶基因定位和结构研究 Woo等[2]在1983 年对PAH基因成功进行了分离、克隆,为PKU的分子诊断奠定了基础。PAH 基因定位于染色体12q22－q24.1 ,大约由９０ｋb 碱基组成。PAH 基因是割裂基因,编码区包含13 个外显子,被不编码的12 个内含子所分隔。转录时剪接内含子形成仅包含外显子的1353bp 的单链,即包含451 个密码子的可译框。mRNA 翻译成含451 个氨基酸的酶单体,单体聚合成有功能的PAH 酶[3-4]。 2 苯丙氨酸羟化酶基因突变 迄今已经发现PKU有440 多种致病突变(http://www.mcgill.ca/pahdb) ，国内仅发现40余种突变。PAH 基因的突变大部分位于编码区，在PAH基因中仅仅影响一个或多个氨基酸，其对酶活性的影响强烈依赖于突变的形式和位置。根据对PAH酶活性有无影响，突变又可分为致病突变和沉默突变。致病突变大多位于外显子或内外显子的交接区，严重影响PAH基因转录和翻译及蛋白质的异常折叠、聚合，以及加速降解，从而影响PAH的催化活性。沉默突变对PAH活性无影响。 PAH基因突变具有以下特点[5]:①突变位点多变，所有外显子、内含子、5′-U TR 和3′-UTR 区均发现突变,突变不能单从CpG位点解释；②突变类型多样，有错义突变( 63%)、小缺失(13%)、剪接位点突变(11%)、沉默突变(7%)、无义突变( 5%)、小插入( 1%), 大片段插入罕见( <1%)，但大部分是错义突变；③突变呈现明显的异质性，不同种族和地区人群之间PAH基因座突变部位及分布具有较大差异。PKU是单基因突变，但以复合杂合子居多，大部分PAH基因必然有两个等位基因突变。世界各国学者都在致力寻找PAH基因的高频突变等位基因，以便探索PKU的分子诊断、产前诊断及携带者检查。欧美白种人PKU 患者的常见突变位于外显子12 和内含子12，分别为R408Q (31%) 和IVS12nt G2 > A (11%)。东方PKU 患者的常见的突变位于外显子12 和7 , 分别为R413P（25%) 和R243Q(18%)[6-11]。这些PAH基因常见突变位点的研究有利于建立PKU 的分子诊断,以便于实现PKU 的早期诊断和产前诊断。 3 苯丙酮尿症分子诊断方法 PCR 技术是Mullis 等建立的一种在体外酶促复制目的DNA 片段的方法, 一般包括变性、退火、延伸3个基本过程, 使目的DNA 片段以指数形式扩增。PCR 及其衍生技术在苯丙酮尿症分子诊断中有着极其广泛的应用[12],如PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、PCR - 单链构象多态性分析( PCR-SSCP)、PCR - 变性梯度凝胶电泳( PCR-DGGE)、PCR扩增特异的等位基因分析（PCR-PASA）、PCR－寡核苷酸探针斑点杂交（PCR–ASO）、聚合酶链反应-短串联重复序列(PCR-STR)等。 3.1 PCR-限制性片段长度多态性分析 限制性内切酶被称为基因工程的手术刀, 它的特点是能够准确识别特定的碱基序列,并进行切割, 如AluⅠ只能识别AGCT 序列并将GC 间的磷酸二酯水解。当基因点突变的位置与某种限制性内切酶的酶切点相关时, 突变将会减少或增加原有的内切酶位点。选择适当的内切酶, 分别处理正常和突变的基因, 由于缺失、重排或碱基置换的结果，使DNA分子中原有的某种限制性内切酶的识别位点发生改变，或是消失或是增加，所以酶切后生成的DNA片段的长度也随之改变，经高分辨率电泳分离后, 通过电泳图谱分析判断点突变发生与否。这种DNA限制性片段长度的变化往往同某种疾病有连锁关系，因而可作为这种疾病的诊断指标[13]。优点：提高了基因分析的灵敏度，无需标记或放射性探针杂交过程, 具有分辨率高，重复性好，简便快速直观。缺点：因为我国人群中80% PAH基因的单体型为ÌV型, 大部分人为纯合状态, 在中国人中应用RFLP 连锁分析对PKU 的产前诊断效果很差。 3.2 PCR - 单链构象多态性分析 由Orita 等在1989 年首先创立。由于在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及分子诊断、基因制图等领域。当DNA 单链自发形成二级结构时, 其构象又取决于DNA 分子的一级结构。通过放射性核素标记自显影或者银染, 根据聚丙烯酰胺凝胶电泳中不同构象影响DNA 片段的迁移率, 来区分正常基因与异常基因。张誌等[14]采用PCR-SSCP检测40例经典型ＰＫＵ患者和30名正常对照的ＰＡＨ基因，结果在ＰＡＨ基因上８个外显子共发现１１种突变和3种多态, 其中R243Q和Y204C为两个高频突变位点。张军力、孟峻等也采用PCR-SSCP对内蒙古地区苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶基因突变进行检测，确认了G239D( G →A) 为首次发现的新突变[15]。PCR－SSCP法具有能快速、灵敏地检测有无点突变或多态性的优点，突变条带与野生型分开后可用于分析，无需特殊设备原理和操作简单，技术容易掌握；实验步骤少，周期短；成本低，所用试剂均价格低廉；可用非同位素法检测；适用于大样本筛选。在测序之前，如能采用本法筛选出所需测序的样本，可大大避免盲目测序带来的人力、物力和时间上的浪费，加快测序工作的进度。PCR-SSCP技术的缺点：不能确定变异的位置，还需通过序列分析来确定，检测存在假阳性，分析片段的大小受限，强烈依赖实验条件之选择，可能会漏检突变，序列未知DNA片段无法使用。 3.3 PCR - 变性梯度凝胶电泳 DNA分子的稳定性主要依靠配对碱基间的氢键维系, A-T 间有2个氢键, G-C 间有3个氢键。当温度升高到一定程度时, 氢键断裂, 两条单链分开，习惯上称这一温度范围的中点为解链温度(Tm) 。不同的DNA 分子由于碱基组成不同而有各自不同的Tm，当一段DNA 序列中发生点突变时其Tm 也将随之发生了变化。DGGE 技术正是利用了这一原理，在设计引物时使扩增的目的片段两端具有不同的Tm 值,一端较高, 另一端相对较低。同时PCR 产物分离所用的聚丙烯酰胺凝胶上事先加入变性剂, 并形成由低到高的浓度梯度。当PCR 产物进行电泳时，不同的DNA 片段在特定的浓度位置发生变性, 由双链解离成单链，导致片段的迁移率大幅度下降。这样不同的片段变性时间不同，它们在凝胶中位置也就不同，据此就可以区别正常片段与异常片段。Per Guldberg等[16]采用PCR-DGGE对丹麦的PKU患者进行检测，证实该方法操作简单，稳定性好，能够快速准确诊断出苯丙酮尿症。顾学范等[17] 通过变性梯度凝胶电泳(DGGE) 突变检测和固相DNA 直接序列分析等方法，对58 例PKU患儿进行突变检测，共发现有IVS6nt21 的G→A 突变和Arg252Gln 突变的患儿7例，均有典型的PKU 临床表现，并有不同程度的智能低下，苯丙氨酸浓度均大于1. 2 mmol/ L。PCR-DGGE优点：良好重复性和极高的灵敏度，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适范围为100bp-500bp。该法一经建立，操作也较简便，适合于大样本的检测筛选。缺点：由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变[18]。 3.4 PCR 扩增特异的等位基因分析 PCR-PASA 最先由Sommer 用于PKU基因的检测[19]。其原理是根据DNA 聚合酶, 只有在寡聚核苷酸引物3′末端碱基与模板相应碱基完全相配时才能催化形成磷酸二酯键, 使引物延伸。如果引物末端3′碱基位对应的模板位碱基发生点突变, 则PCR 反应将无法进行。这样, 通过设计不同长度的引物, 以改变引物3′端碱基的位置, 根据PCR 反应发生情况, 得知对应模板位碱基是否发生了点突变[20]。 3.5 PCR –寡核苷酸探针斑点杂交主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段，然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针，逐一筛查，来检测PKU患者的点突变。杂交:PCR-ASO是将PCR扩增产物点于杂交膜上，然后与上述的ASO探针杂交，根据杂交的结果判断分析，以确定突变位点。反向斑点杂交（RDB）改变传统的杂交途径，它是将一系列的标记ASO探针固定在膜上，然后用之与PCR扩增产物进行杂交。朱月春等在云南对14 个PKU 家系14 例患儿的PAH基因Exon - 11采用PCR–ASO方法进行检测。 结果检出两种突变，分别是Y356X (TAC →TAA) 和V399V (GAT→GTT) , 突变频率均为7.14 % , 前者略高于北方人群, 后者低于北方人群。PCR – ASO技术的优点：快速，使检测程序大大简化[21]。缺点：因为当一个基因有多种突变等位基因时,ASO 探针的应用价值就会下降, 还有操作复杂、放射性核素污染等不可克服的缺点, 此外约30% 左右的PAH 基因突变尚未被确定。 3.6 聚合酶链反应-短串联重复序列 已有研究表明, PAH 基因内含子中存在大量的STR, STR 多态是进行连锁分析的重要遗传标记，可以用PCR-STR连锁分析技术实现PKU分子诊断[22-24]。PAH 基因内含子3 中有一短重复序列，该STR 的核心序列为[TCTA]n。欧洲人群检测出9种STR 等位基因,扩增片段长度在228－260bp 之间,杂合子频率为81 % ,该位点的多态性信息量(PIC)为0.80[18] 。我国人群中也检测到9 种STR 等位基因,但扩增片段长度224－256bp ,杂合子频率为64 %－69.6 % ，正常人群PIC为0.585－0.654 , PKU家系PIC 为0.693－0.730。宋力等采用PCR-STR方法成功的完成了5 个家系6 个胎儿的产前快速基因诊断,淘汰了2 例P KU 胎儿,保留了正常胎儿[25]。PCR-STR的优点：简便、可靠、实用的,不需使用放射性核素及限制性内切酶, 凝胶银染显带效果好, 易操作、易保存, 便于分析。缺点：不能直接检出PKU 突变位点或提供的产前分子诊断信息量有限,故直接影响产前分子诊断率。 3.7实时荧光定量PCR分析 TaqMan实时荧光定量PCR技术[26]是美国PE公司开发的，目前已经用于基因检测方面。该技术的基本原理是合成一条能与PCR模板杂交的探针（TaqMan Probe）, 该探针的5’端标记荧光报告基团(R)， 3’端标记荧光淬灭基团。探针5’端的R基团在无特异性PCR发生时, 3’端荧光淬灭基团能够吸收或抑制5’端R基团发出的荧光, 荧光信号不改变；当有特异性PCR发生时,探针会在PCR的过程中被Taq酶的5’→ 3’的外切酶活性作用切出（切口平移效应），淬灭基团的抑制作用消失。切出的R基团与PCR产物的数目是一对一的，从而引起报告基团荧光信号的增长，通过电脑自动检测红绿荧光的变化就能作出基因诊断。张誌等[27]应用荧光定量PCR技术检测了经典型PKU的基因突变，发现了PAH基因第7外显子的R243Q点突变在中国PKU患者中具有较高的突变率，同时也表明该技术是PKU的分子诊断的良好技术平台。该方法具有以下的优点：在闭管状态下进行扩增产物检测, 避免了扩增产物污染而致的假阳性；探针杂交特异性更强；无需酶切位点存在；PCR后无需后续处理，结果判断借助仪器软件自动判读，客观性强；操作更简单快速，重复性强,适合于大量样本的检测。DNA测序表明该方法准确性很高。缺点：只能对已知的多态性位点进行分析。 3.8 基因芯片技术基因芯片是生物芯片的一种。它采用微电子、微加工技术在硅芯片、玻片、聚丙烯膜、尼龙膜等材料上, 原位合成寡核苷酸或将大量预先合成的DNA 探针有序地固化于这些支持物表面,与待测样本进行杂交。通过检测杂交信号，对大规模的分子生物学信息进行快速、准确的自动化分析[28]。基因芯片按照制备工艺的不同, 可以分为原位合成芯片和DNA 微阵列芯片; 按照用途的不同又可分为用于未知测序的芯片和用于已知测序的芯片两大类[29]。在基因点突变的检测中最常使用的是寡核苷酸微阵列芯片, 芯片的探针检测中心采用叠瓦式设计策略。许多已知顺序的寡核苷酸DNA被排列在一块集成电路板上,彼此之间重叠一个碱基,并覆盖整个所需检测的基因，荧光标记的正常DNA和突变DNA分别与两块DNA芯片杂交,由于至少存在一个碱基的差异，正常DNA和突变DNA将会得到不同的杂交图谱，通过共聚焦显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号即可确定是否存在突变。基因芯片技术优点：快速简单、自动化程度高，具有很大的发展潜力。缺点：费用较高，不稳定。 4 结 语 随着分子生物学的飞速发展, 特别是PCR 及其衍生技术、全自动DNA 测序和基因芯片技术的广泛应用, 对PKU分子诊断方法的研究越来越深入，有助于实现PKU的早期诊断和产前诊断。就目前的技术手段而言，PCR-SSCP和PCR -DGGE是常用的方法。但实时荧光定量PCR、RDB斑点杂交和基因芯片技术由于各自独有的优点，相信在PKU的分子诊断方面会得到更广泛的应用。 参考文献 [1] 顾学范.中国580万新生儿苯丙酮尿症和先天性甲状腺功能减低症的筛查.中华预防医学杂志,2004,38(2): 99-102. 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