（武汉大学中南医院检验科，湖北 武汉 430071）
【摘要】目的 探讨线粒体DNA ND1基因3394 (T→C) 突变与武汉地区人群2型糖尿病的关系。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和测序的分析方法，对95例2型糖尿病患者和168例健康对照进行筛选，并用DNAMAN、Primer和mfold软件进行二级结构预测分析。结果 实验组检出3394 (T→C) 突变3例 (3.2%)， 对照组未检出突变，两组间突变率差异有统计学意义(P<0.05)。3394 (T→C) 突变导致Tyr→His ，mfold软件预测显示3394突变后ND1基因DNA二级结构不同于野生型。结论 线粒体DNA ND1基因3394 (T→C) 突变，可能与2型糖尿病的发生发展有关。
【关键词】线粒体DNA； 突变； 2型糖尿病； 二级结构预测
Mitochondrial DNA ND1 gene 3394 (T→C) point mutation and type 2 diabetes mellitus
HE Xuemin,ZHOU Xin. Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China.
Abstract: Objective To explore the relationship between mitochondrial DNA point mutation of 3394 T→C and type 2 diabetes mellitus(T2DM) in Wuhan population. Methods 95 cases of T2DM and 168 healthy controls were determined by PCR-restriction fragment length polymorphism and DNA sequencing. All mutations were analyzed by DNAMAN,Primer and mfold softwares. Results In diabetic group, there were 3 carriers (3.2%) of 3394 T→C (Tyr→His) mutation; None carrier was found In controls. There was significant difference between two groups for np3394 mutation frequencies (P < 0.05). The secondary structure prediction revealed that there were differences between np3394 mutant and wild-type ND1 gene. Conclusion mtDNA ND1 gene mutations at np3394 might implicate in the pathogenesis of T2DM.
Key words: Mitochondrial DNA；mutation；T2DM；Secondary structure prediction
线粒体基因是目前发现的除核基因以外惟一存在于人细胞质中的DNA分子，具有自我复制、转录和编码功能。线粒体基因缺陷可导致胰岛素分泌障碍[1-5]，从而参与糖尿病的发生。有关糖尿病与mtDNA基因突变的研究国内外有很多报道，其结果不一。本文采用PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）、DNA测序和结构预测的分析方法，对武汉地区95例2型糖尿病(T2DM)患者和168名健康对照mtDNA的ND1基因(np3307～4263)的3394（T→C）突变位点进行筛选检测，结果如下。
1 对象和方法
1.1 对 象
按照1997年美国糖尿病学会制订的T2DM诊断标准, 确认实验组患者95例(男61, 女34), 平均年龄58岁,均无亲缘关系。对照组为健康体检者168名(男101, 女67), 平均年龄57岁。两组年龄和性别均匹配（P>0.05）。对照组排除糖代谢、脂代谢和内分泌紊乱的相关疾病，临床检查和实验室检查结果未见异常。
1.2 方 法
用NaI方法提取EDTA抗凝外周血DNA作为模板。参考文献[2]设计引物，P1 ：5’-AGCGC CTTCCCCCGTAAATG-3，p2： 5’-AGAATGATGGCTAGGGTGACTT-3’（引物由武汉伯杰公司合成）；扩增产物长度为596bp,经1%琼脂糖电泳鉴定后，用内切酶HaeⅢ进行酶切。20μl反应体系包括：10×Buffer 2μl，10mg/ml BSA 0.5μl ，PCR产物6μl，HaeⅢ 1U，37℃水浴16小时。所有酶切产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显影观察结果。将电泳条带不同于野生型的PCR产物进行双向测序，并经DNAMAN和Primer软件分析，鉴定突变位点及其编码相应氨基酸的改变，采用mfold软件对野生型和突变后的ND1基因进行二级结构预测。
1.3 统计分析
采用SPSS 11.0统计软件的Fisher 精确概率法、χ2检验进行分析，统计检验水平为双侧0.05。
2 结 果
2.1 HaeⅢ酶切结果
HaeⅢ切割位点为gg^cc, 无突变者，在3316、3413、3428和3608处存在酶切位点，酶切产物均为180bp,157bp,147bp,97bp,15bp五个片段。如果发生3394 T→C突变（Tyr→His），新的酶切位点将97bp片段切为76bp和21bp两个片段，酶切产物有六个片段，但由于21bp太小，在图中观察不到，结果见图1。本研究在实验组发现np3394突变3例（3.2%），对照组未检出突变。两组间np3394突变率差异有统计学意义（P< 0.05）。
2.3 ND1基因二级结构预测分析
Primer软件分析显示3394（T→C）突变，编码的相应氨基酸有改变，mfold软件也证实了其二级结构（图3b）与野生型(图3a)不相同。
3 讨 论
1992年，Nakagawa和Ouweland等[1]分别报道了线粒体tRNALeu(UUR) 3243 A →G突变与糖尿病的关系而受到各国学者的重视。近年来国内也对线粒体基因突变与糖尿病关系进行了研究[4，5]，结果表明基因突变易使患糖尿病的易感性增加。
本文通过HaeⅢ酶切和测序研究, 对95例T2DM患者和168例健康对照mtDNA ND1基因 3394(T→C))突变进行了筛选。实验表明,3394(T→C)突变率在实验组为3.2%，对照组为0%，两组差异有统计学意义。该突变位于ND1基因，是ND基因中最保守的，其表达产物为NADH 脱氢酶（复合体Ⅰ）亚单位Ⅰ[1]。Primer软件分析显示 np3394突变, 使一个亲水性中性 酪氨酸( Tyr)被亲水性的碱性组氨酸( His)取代，mfold软件预测其最小自由能下的二级结构（图3b）发生了明显的改变，据此推测,该突变影响呼吸链复合体Ⅰ酶活性，导致线粒体氧化磷酸化功能受损，减少ATP生成, 而胰岛B细胞所需能量的94 % 来自呼吸链,降低胰岛β细胞分泌胰岛素的能力，延迟胰岛素释放，促使了糖尿病的发生发展[1-5]。
参考文献
[1] Nakagawa Y，Ikegami H，Yamato E，et al.A new mitochondrial DNA mutation associated with non insulin dependent diabetes mellitus[J]..Bio Chem Biophys Res Commun，1995，209：664-668.
[2] Fukuda M, Nakano S, Imaizumi N, et al. Mitochondrial DNA mutations are associated with both decreased insulin secretion and advanced microvascular complications in Japanese diabetic subjects.[J]. J Diabetes Complications， 1999, 13: 277-283.
[3] Perucca-Lostanlen D, Narbonne H, Hernandez JB, et al . Mitochondrial DNA Variations in Patients with Maternally Inherited Diabetes and Deafness Syndrome[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2000,277: 771–775.
[4] 钱杰 张丽容。线粒体DNA ND1基因点突变与2型糖尿病的关系[J].中华内分泌代谢杂志，2003，19（1）：46-47.
[5] YU P , YU DM , LIU DM , et al. Relationship between mutations of mitochondrial DNA ND1 gene and type 2 diabetes[J]. Chin Med J (Engl) , 2004, 117 : 985-989.
