翁翠萍，毕永春
【摘要】 目的 寻求一种准确、可靠，不需要特殊设备的尿本周氏蛋白的测定方法，以利于在基层医院开展，提高多发性骨髓瘤（MM）的诊断水平。方法 用酶联免疫双抗体夹心法检测尿中的本周氏蛋白，并与免疫固定电泳法和热沉淀法比较。结果 用酶联免疫法检测20例轻链型，与免疫固定电泳法相比较有85%的符合率，比经典的热沉淀法大大提高了检出率。结论 本法简便、准确、可靠，不需要特殊设备，便于基层医院推广，对减少MM的误诊、漏诊有一定的意义。
【关键词】 本周氏蛋白；多发性骨髓瘤（MM）；酶联免疫法
近几十年来，随着我国人口逐渐老年化，高年龄化社会的出现，以及环境的污染，MM的发病率逐渐升高。MM是一种单克隆性浆细胞恶性增殖和异常聚积为特征的肿瘤，多发于中老年人，在恶性血液病中占10%～15%，大多数具有极高的病死率，该病的主要免役特点是血和尿中出现单克隆免疫球蛋白（即M蛋白），普及和提高M蛋白病检测手段的重要性日益显著，其中尿本周氏蛋白是诊断多发性骨髓瘤的重要实验室依据之一，尿M蛋白测定的众多方法中，以速率散射比浊法，免疫蛋白电泳法为主，具有灵敏、快速、特异性强等优点而被推荐，但这两种方法都需要特殊或昂贵的仪器设备，从而阻碍了在基层医院中的推广。本试验介绍孔宪涛等［1］曾报道用酶联免疫法测本周氏蛋白的方法，并与免疫固定电泳法及热沉淀法相比较，探讨其临床应用价值。
1 材料与方法
1.1 标本来源 20例轻链型MM患者的尿液取自南京各医院已确诊的轻链型MM患者，其中男12例，女8例，年龄38～72岁，平均56岁。
1.2 仪器与试剂 上海Helena ReP电泳仪及其试剂盒（免疫固定电泳用），Benchmark酶标仪为BIO-RAD公司产品，酶联免疫试剂盒为晶美生物工程公司提供，批号为20031208，其他辅助试剂自配。
1.3 方法
1.3.1 稀释标本：用pH9.5浓度为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液,将患者尿液1：500稀释。
1.3.2 分别加稀释后的患者标本和κ标准品，λ标准品，正常混合尿液，各100μl于微板孔中，标本做复孔，同时做空白对照，置37℃ 2h。
1.3.3 甩干，加封闭液150μl/孔，37℃ 1h。
1.3.4 甩干，按酶联免疫试剂盒说明规范操作。
1.3.5 用酶标仪在490nm测OD值，P/N值＜2.1或肉眼无色或淡粉红色为阴性。P/N≥2.1或肉眼红色为阳性。
1.3.6 标本同时做免疫固定电泳和热沉淀法检测尿本周氏蛋白。免疫固定电泳技术（IFE）定性测定：将同一份样本点在琼脂板上的6个不同位置，通过电泳将带有不同电荷的蛋白质分开，然后将IgG、IgA、IgM、κ、λ的抗血清分别加入到各条电泳区带中，如有对应的抗原存在，则会在实验标本的适当位置有抗原抗体复合物形成，并沉淀下来，抗原抗体沉淀区能被氨基黑着色，IFE法敏感性高，易于观察。
热沉淀法：将一定pH的待测尿液加热至45℃～60℃时，有蛋白开始凝固，继续加热至90℃～100℃时，凝固蛋白重新溶解，再冷至60℃以下，又出现凝固，正常人尿中无此种蛋白，多发性骨髓瘤病人尿液中可出现。
2 结果
酶联免疫双抗夹心法，免疫固定电泳法和热沉淀法检测尿本周氏蛋白的结果见表1。表1 三种方法检测尿本周氏蛋白阳性结果的比较
3 讨论
免疫球蛋白由一对轻链及一对重链组成，重链有γ、α、μ、δ、ε五种分别对应于IgG、IgA、IgM、IgD、IgE；轻链有两种，每种免疫球蛋白或含κ轻链，或含λ轻链，游离轻链又称本周氏蛋白，是一种多年前有Bence Jones在一多发性骨髓瘤患者的尿液中发现的，本周氏蛋白在40℃～60℃凝固，温度上升到90℃～100℃时溶解，故又称为凝溶蛋白。
免疫球蛋白是在B淋巴细胞内合成的，B淋巴细胞有三个基因库，即重链、轻链κ、轻链λ，重、轻链的合成基本上处于平衡状态，轻链的分子量为22KD左右，在血（尿）中以单体或二聚体形式存在，二聚体间以共价二硫键连结或以共价键连结。在正常人血（尿）中有微量的游离轻链，而血中有利轻链的浓度则维持在一定范围［2］，肾脏的排泄和分解是清除轻链的主要方式，和其他小分子蛋白一样，轻链从肾小球滤过，约95%的滤过的轻链在近肾小管又被重吸收，并被肾小管上皮细胞分解，非共价键二聚体首先在血浆中分解为单体，因为只有单体才能通过肾小球，滤过的单体在肾小管中又可以再次聚合，并出现在尿中，当细胞分泌轻链与重链不配对或肾功能损害时，血（尿）中游离轻链升高则引发多发性骨髓瘤、自身免疫性疾病、肾源性疾病等［3］。
多发性骨髓瘤的诊断依靠以下表现：(1)骨髓中浆细胞增多症或组织中出现浆细胞瘤的证据；(2)血和尿中出现本周氏蛋白；(3)多发性骨髓瘤时，由于单克隆B淋巴细胞恶性化增殖引起体液免疫功能发生异常，产生大量单克隆免疫球蛋白（即M蛋白），M蛋白可在血清或尿液中出现，M蛋白重链各不相同，而轻链只有两种（κ、λ），单个免疫球蛋白分子轻链总是同型的，正常时血和尿中两种轻链常维持恒定比例，κ/λ比率约为2.0，κ/λ比率测定对MM尤其是轻链型MM的早期诊断及鉴别诊断有很高价值［4］。
本试验与免疫固定电泳法相比较其优点是：操作简单，不需要贵重仪器、设备，成本低，可靠性大，阳性率较高，结果显示与免疫固定电泳法相比符合率达到85%，与孔宪涛等报告的基本相符。与传统的热沉淀法相比较，热沉淀法操作简单，但敏感性和准确性太差，而酶联免疫法的阳性率是热沉淀法阳性率的2倍多，大大提高了阳性检测率，降低了漏检率。因此，酶联免疫法检测本周氏蛋白，操作简便、准确，结果可靠，不需要特殊设备，便于在基层医院开展推广，可用于临床上对M蛋白病的诊断、分型和病情监测以及对减少多发性骨髓瘤的误诊、漏诊都有一定的临床应用价值。
【参考文献】
1 刘炎，高峰，孔宪涛，等.速率散射比浊法、酶联免疫法检测轻链在多发性骨髓瘤诊断中的意义.中华血液学杂志，1995，16(11)：605.
2 谭立明，彭卫华，王外梅，等.免疫球蛋白及轻链检测在多发性骨髓瘤诊断中的临床意义.江西医学院学报，2003，43(4)：32-34.
3 扶云碧.血（尿）轻链升高的临床意义.国外医学·临床生物化学与检验分册，2002，23(3)：151-152.
4 周京国，张国元，唐中，等.血尿中κ、λ轻链含量及比值对多发性骨髓瘤的诊断价值.华医医学，1999，14(4)：46-417.
作者单位： 1 233000 安徽蚌埠，蚌埠市第一人民医院检验科
2 江苏南京，南京鼓楼医院检验中心
