中华医学检验杂志 1998年第3期第21卷 论著摘要
作者：刘杰 魏海明 田志刚 冯进波
单位：250062 济南，山东省医学科学院基础所山东肿瘤生物治疗研究中心
细胞因子的基础研究证明，多种细胞因子与疾病的发生发展过程有关，越来越多的细胞因子或细胞因子拮抗剂应用于疾病的治疗，建立特异而敏感的细胞因子检测方法，对解释细胞因子与疾病的关系，指导细胞因子的临床治疗十分重要，我们建立了逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和RNA斑点杂交方法，检测20株肿瘤细胞中白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10、IL-13和γ干扰素(IFN)γ等5种细胞因子的表达状况，获得较好结果，现报告如下。
一、材料和方法
1.肿瘤细胞株：淋巴瘤细胞5株，骨髓瘤细胞2株，白血病细胞2株，肺癌细胞4株，乳腺癌细胞3株，黑色素瘤细胞2株，膀胱癌和结直肠癌细胞各1株，依各细胞性质分别行贴壁或悬浮培养。
2.PCR引物：根据5种细胞因子和β-actin的cDNA序列,分别设计上游和下游引物，由美国Galifornia大学高斌博士合成并惠赠。
3.RNA提取：按GIT一步法提取，紫外分光光度法测RNA含量，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。
4.RT反应：取5～10 μg RNA，加入0.1mol/L DTT 2 μl,莫洛尼鼠白血病病毒( M-MLV) 200 U(1 μl)，4×dNTP(每种10 mmol/L) 1 μl, 下游引物P2 0.5 μl(50 pmol), 总反应体积20 μl。37℃ 1小时后，经95℃ 10分钟灭活M-MLV。
5.PCR反应体系：20 μl RT反应产物，15 mmol/L MgCl2 13.3 μl，4×dNTP 1 μl，上游引物P1 0.5 μl(50 pmol)，TaqDNA聚合酶2 μl(1 U/μl)，循环条件为94℃ 1分钟，58℃ 1分钟，72℃ 1分钟，循环35次，末次72℃，延长7分钟，电泳鉴定。
6.mRNA斑点杂交：分别含有质粒β-actin、IL-2、IFNγ、IL-4、IL-10、和IL-13的大肠杆菌菌株由本室冻存，并按常规方法提取质粒，用切口平移法标记生物素化的各细胞因子探针，按本室常规进行mRNA斑点杂交。
二、结果
1.RT-PCR检测5种细胞因子基因表达实验条件的选择：以IL-10为例选择不同RNA量，分别用Oligo dT12～18，单一下游引物P2和5种细胞因子下游引物做RT反应，用不同RT产物做PCR反应，结果表明，用5～10 μg RNA，以下游引物P2作RT反应，并取全部RT产物（20 μl）作PCR反应，能取得较好结果。
2.RT-PCR检测5种细胞因子的电泳结果：以HT29细胞和Daudi细胞为例，经RT-PCR检测后，β-actin、IL-2、IFNγ、IL-4、IL-10、IL-13分别在500、458、494、456、249和300 bp处出现明显条带，与预定结果相符。
3.RT-PCR和RNA斑点杂交结果的比较：两者的结果基本一致。两种方法同时应用，会取得准确结果。
4.20种人肿瘤细胞株5种细胞因子的基因表达结果：包括结直肠癌、膀胱癌、黑色素瘤、乳腺癌和肺癌在内的11株实体瘤中，IL-2、IFNγ、IL-4、IL-10、IL-13的表达分别为1/11、2/11、9/11、10/11和10/11，包括淋巴瘤、骨髓瘤和白血病在内的9株血液系统肿瘤细胞株，上述5种细胞因子的表达依次为7/9、6/9、9/9、9/9和9/9。
三、讨论
RT-PCR是用来检测基因表达状况的一种快速、灵敏、特异的方法，并可进行半定量，在特异引物的引导下，可以从低丰度mRNA逆转录产物中扩增出近μg级的cDNA产物。通常进行重组克隆时，提取目的基因表达高丰度的细胞总RNA进行RT-PCR以获得目的DNA片断，20 μl RT反应体系只取5 μl即可进行PCR，最终的扩增产物10 μl即可以在1.5%琼脂糖电泳上观察出明显的条带。但在本次进行5种细胞因子基因表达的检测时发现，上述的方法不能获得肉眼可见的扩增条带，并且传统的Oligo dT12～18法在灵敏度和特异性方面与下游引物P2法相比都表现出极大的差距。于是，我们提取了1×105肿瘤细胞的总RNA，每种细胞因子的RT体系中加入5～10 μg RNA，将20 μl RT反应产物全部用于1种细胞因子的PCR,即获得了清晰的扩增带影。RT-PCR技术在具有高度灵敏性的同时，势必容易产生假阳性结果，出现非特异性的扩增条带。因此，进行RT-PCR时应注意：（1）引物设计的特异性；（2）PCR反应时适当提高退火温度；（3）PCR扩增产物应有相应的技术同时操作进行特异性鉴定，如Northern转印杂交、RNA斑点杂交、PCR产物电泳后转印杂交等。RNA斑点杂交是一种检测细胞因子的优选方法，该法忠实性强，可直观了解各种细胞因子的表达状况，并且操作过程中对RNA酶控制的要求可相对放松，便于掌握。但采用生物素标记探针进行RNA斑点杂交时，有时也会有非特异着色现象，可通过提高洗膜温度、延长洗膜时间等方法提高其特异性。该法的另一不足是操作繁琐，同时进行多个样品检测时易导致RNA降解，若控制好反应条件，可获得满意的结果。
参考文献
1Abbas AK,Murphy KM, Sher A. Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature,1996,383：787-793.
2 Mosmann TR， Sad S.The expanding universe of T-cell subsets:Th1,Th2 and more.Im Today,1996,17：138-146.
