中华医学检验杂志 1998年第3期第21卷 论著
作者：魏军 张正
单位：100044 北京医科大学人民医院检验科(魏军系研究生，现在宁夏医学院附属医院检验科，邮编750004)
关键词： 人乳头瘤病毒；杂交；聚合酶链反应
【摘要】 目的 建立聚合酶链反应(PCR)产物直接酶标记微孔板反向分子杂交法用于人乳头瘤病毒(HPV)型别鉴定。方法 利用HPV通用引物介导PCR（GP-PCR）扩增靶DNA，然后对产物直接标记辣根过氧化物酶复合物（HRP-PEI-QI）,与预先包被在微孔板上的HPV寡核苷酸探针杂交后酶显色法检测。结果 HPV各型之间无交叉杂交；杂交灵敏度可达13～76个病毒DNA拷贝，比PCR-琼脂糖凝胶电泳检测高10倍；该法重复性好，阳性孔批内CV为6.34%，批间CV为10.53%，阴性孔批内CV为1%，批间CV为5.79%；而且杂交影响因素较少。结论 该法特异性强、灵敏度高、操作简便，无放射性和E.B.染料污染，杂交时间短、仪器读取结果，便于大量常规临床样本定性或定量检测。
A novel method of directly labeling PCR products and hybridization in microplate for typing human papillomaviruses Wei Jun, Zhang Zheng. Clinical Lab, Afflicted Hospital, Beijing Medical University, Beijing, 100044
【Abstract】 Objective To develop a easy method for detecting and typing HPVs.Method General primer mediated PCR (GP-PCR) was applied successfully to detect a broad spectrum of HPV in cervical scrapes and paraffin wax embedded specimens diagnosed pathologically as squamous cell carcinoma of the cervix uterine. To facilitate HPV typing, a calorimetric microplate base hybridization assay was developed. The PCR products were directly labeled with HRP complex (HRP-PEI-PBQ). The microplate was previously covered with avian which can bind a biotinylated HPV-probe, then fixed with the biotinylated HPV genomic probes mix and type specific probes respectively. Hybridization was completed in a short time and the hybridized signal was detected by ELISA-like assay.Results Since this method is highly specific, no cross-hybridization was noted between all types of HPVs. The sensitivity was ten times higher than that of agrose-electrophic the lowest concentration of template was 13-76 copies of HPV DNA.Conclusion The method is of potential use for routine HPV examination of clinical specimens.
【Key words】 Human papillomavirus Hybridization Polymerase chain reaction
目前已知，人乳头瘤病毒(HPV)与人类疾病，特别是恶性肿瘤及癌前病变密切相关［1］，其致病性与型别有关。因此，HPV临床检测，尤其是型别鉴定，日益受到重视，临床上有必要建立一种简便、快速、灵敏、特异的分型检测方法。
我们选用Manos等［2］设计的一对能与多型HPV退火的通用引物进行聚合酶链反应(PCR)，建立了PCR-微孔板反向分子杂交法进行HPV分型检测,现将结果报告如下。
材料与方法
一、材料
1.标本来源：临床标本共100份，取自宁夏医学院附属医院、北京妇产医院和山东菏泽医院，其中病理诊断为低分化鳞癌的宫颈石蜡切片40份；宫颈刮片或活检组织40份；正常宫颈石蜡切片20份。
2.主要试剂与仪器：HPV16重组质粒DNA由北京医科大学口腔医院李盛琳老师惠赠；HPV18型DNA从Hella细胞中提取。dNTP为Boehringer Mannheim 产品；Taq DNA聚合酶和PCR Marker为Promega产品；亲合素、戊二醛和N-羟基琥珀亚胺(长链生物素)为Sigma产品；HRP复合物为北京人民医院血液病研究所产品；酶标板为丹麦Nunc公司产品；DNA扩增仪480型为美国PE公司产品。
二、方法
1. 引物和寡核苷酸探针：根据文献［2］，引物是从HPV L1区中选择保守序列设计，上游引物MY11为5′-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3′，下游引物MY09为5′-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3′(M=A+C,R=A+G,W=A+T,Y=C+T)，由人民医院中心实验室合成，预期扩增片段为450 bp；基因组混合探针（GP）序列选自HPV L1区中另一保守序列，可与MY11和MY09引物产生的多种HPV扩增产物杂交；HPV基因组混合探针和HPV16型特异探针（MY14）3′端均标记生物素，HPV18型特异探针（WD74）5′端标记氨基，按文献［3］标记生物素。寡核苷酸探针均由美国Synbercen公司合成。
2. PCR模板制备：按文献［4］制备，取上清液5 μl用于PCR检测。
3. 聚合酶链反应：循环参数如下：94℃，预变性5分钟；然后94℃，45秒；55℃，45秒；72℃，45秒；循环35圈；最后72℃继续延伸5分钟。取10 μl产物于1.8%琼脂糖凝胶上电泳，观察在450 bp处有无扩增带或进行微孔板杂交。
4. 产物直接标记辣根过氧化物酶复合物：取PCR产物10 μl，94℃10分钟，立即冰浴5分钟；加入HRP标记物10 μl，戊二醛试剂10 μl，混匀，短暂离心后于37℃30分钟，进行标记。
5. 微孔板杂交：每孔加入100 μl亲合素(10 μg/ml)，4℃过夜；PBS洗板3次；加入生物素标记的探针100 μl (探针终浓度为33 μmol/L)，室温作用1小时，PBS洗板3次；每孔加入杂交液100 μl(主要成分为含6mmol/L尿素的Tris-HCl)，然后加入HRP标记的产物15 μl， 42℃杂交20分钟，PBS洗板3次，加入底物液100 μl(0.1mol/L柠檬酸钠，pH 5.5，0.01% TMB，0.03% H2O2)，室温5～10分钟，加入1 mol/L H2SO4 50 μl 终止显色，450/630nm读取吸光度A值。
结果
1. 微孔板杂交特异性实验：将HPV16和18标准DNA扩增产物分别与公用混合探针、16型、18型特异探针杂交，结果表明HPV16和18型产物均能与公用混合探针杂交，但HPV16型产物仅与16型特异探针杂交，而18型产物也仅与18型特异探针杂交，两产物间无交叉反应。说明杂交特异性强。
2. 微孔板杂交灵敏度试验：将模板Hela DNA(HPV18+)稀释成40 ng、4 ng、400 pg、40 pg、4 pg、400 fg、40 fg和4 fg8个浓度分别进行扩增，然后同时用琼脂糖凝胶电泳和杂交分别检测产物，结果见附图。
1：阴性对照；M：DNA Marker；2～9：模板浓度分别为
40、4 ng，400、40、4 pg；400、40、4 fg
附图 PCR-琼脂糖凝胶电泳灵敏度试验结果
随着模板浓度的增加，杂交信号也随之增加；最少模板量可至4 pg（约13～76个HPV病毒拷贝）；而电泳只能检测到40 pg。
3. 杂交时间的优化选择：在其他条件相同时，杂交时间分别为15分钟、30分钟、60分钟和120分钟，从结果可以看出，杂交时间在15～30分钟时信噪比最高，30分钟后，随着杂交时间的延长，信噪比降低。
4. 重复性试验： 本研究测定了8个样本和阴性对照组的批内和批间误差，结果见表1。
表1 PCR-微孔板反向杂交法批内、批间变异系数
| 实验组 | n | 样本孔* ±s |
CV% | 对照孔±s |
CV% |
| 第一次 |
8 |
0.580±0.035 |
(6.04) |
0.021±0.021 |
(1.00) |
| 第二次 | 8 | 0.689±0.035 | (5.08) | 0.018±0.018 | (1.00) |
| 第三次 | 8 | 0.583±0.046 | (7.89) | 0.017±0.017 | (1.00) |
| 3次批间 | 24 | 0.617±0.065 | (10.53) | 0.147±0.058 | (5.79) |
*为吸光度A值
结果表明：样本孔批内CV平均为6.34%，批间为10.53％；阴性对照孔批内CV平均为1％，批间为5.79%。
5. 影响因素探讨：(1) 杂交液中鲱鱼精DNA(HSDNA)对杂交的影响：为观察杂交液中HSDNA在微孔板杂交中的作用，分别两组试验，一组加HSDNA，另一组不加；两组结果经配对t检验，统计学上差异无显著性(P＞0.05)。(2) 封板与否对杂交的
表2 微孔板杂交分型法与琼脂糖电泳法对100份临床标本检测结果
| 分组 | 份数 | 琼脂糖电泳 | 微孔板杂交阳性 |
阳性率(%) |
|||||
| 电泳阳性 | 阳性率% | GP+16+ | GP+18+ | GP+ | GP+16+18+ | ||||
| 宫颈活检刮片 | 40 |
36 |
(90.0) |
27 |
3 | 7 | 0 |
(92.3) |
|
| 宫颈癌切片 | 40 | 31 | (77.5) | 29 | 1 | 0 | 1 | (77.5) | |
| 正常宫颈切片 | 20 | 0 | (0.0) | 0 | 0 | 0 | 0 | (0.0) | |
GP：基因混合探针；16、18分别为HPV16型、18型特异探针影响：杂交孔和本底孔分别设封板与不封板两组平行对照，结果分别经配对t检验，杂交孔t=2.59，P＜0.05；本底孔t=1.916，P＞0.05。
本底孔封板与否均数间统计学上差异无显著性(P＞0.05)；但杂交孔封板与不封板两均数间统计学上差异有显著性(P＜0.05)。
6. 临床样本检测：利用新建立的PCR-微孔板反向杂交分型法与琼脂糖电泳法对临床100份标本进行了检测，结果见表2。
讨论
本法首先利用通用引物PCR，对广谱的HPV感染进行扩增，再经基因组混合探针和型特异探针同时对一管产物分别杂交，这样既可快速检出已知型别，同时基因组混合探针的使用，还可发现未知新型或未知序列的其他型别的感染，这样可提高样本中HPV感染的检出。
本研究结果表明，PCR-微孔板杂交法具有较好的特异性和稳定性，所需时间短，杂交灵敏度明显高于PCR-琼脂糖凝胶电泳检测，最小模板量可达13～76个HPV DNA拷贝，这与Jacobs等［5］报道的双标记微孔板杂交法的灵敏度基本相符。
通过对杂交影响因素的探讨，发现微孔板杂交过程中，不封板，不会因酶的非特异吸附造成本底过高；而增加一个封闭过程反而会使特异杂交信号降低；考虑这可能是因为(1)脱脂奶粉中某些物质封闭了杂交位点或影响了探针游离度；(2)增加封闭过程，可能使探针受到损伤。而且，微孔板杂交也不象膜杂交那样，不一定需要HSDNA的存在来防止核酸非特异附着。
利用新建立的PCR产物直接酶标记-微孔板反向杂交分型法对临床100份标本检测结果表明：20份正常宫颈石蜡切片全部为阴性，与病理诊断的符合率为100％；40份病理诊断为宫颈低分化鳞癌的石蜡切片，经GP-PCR后，琼脂糖电泳和本法的检出率都为77.5%，两法检出符合率为100%；40份宫颈活检、刮片及分泌物标本中，有一例电泳检测为阴性，而本法检出为HPV16阳性，考虑这可能是因标本中模板量较低，而电泳检测的灵敏度低于本法所致。 电泳和本法对活检及刮片中HPV检出符合率为97.3% 。另外，有一例本法检测通用探针及16、18型特异探针均为阳性，考虑为HPV16和18型混合感染。
PCR微孔板杂交技术是近几年出现的一种新的分子生物学检测法，可采用双探针双标记夹心杂交法，也可采用引物与探针双标记杂交。利用产物直接酶标记-微孔板杂交进行HPV感染的检测，尽管此法还未完全成熟，但与其他方法相比具有以下优点：(1)产物直接酶标记，免去双标记，相对成本降低，更为经济，便于临床实验室普及。(2)该法特异性强、灵敏度高、操作简便，试验所需时间短，远少于传统的膜杂交所需时间(一般为18至24小时)，由此可大大缩短试验进程；而且方法稳定性好, 试剂容易购得，便于进行大量样本检测和流行病学研究中样本筛选。(3)无放射性污染及E.B.染料污染。(4)酶标仪读取结果客观，可避免琼脂糖电泳观察中的人为干扰。(5)可以进行PCR定量分析。(6)该法不仅适用于HPV的检测，包被不同探针，还可对相应的产物进行鉴定，有较好的临床应用前景。
参考文献
1Hausen H. Human papillomaviruses and their possible role in squamous cell carcinomas. Current Topic Microbial Immunol, 1977, 78: 1-1.
2Manos M, Ting Y. PCR Protocols: Aguide to methods and application. San Diego: Academic Press, 1990. 365-367.
3王申五.基因诊断技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993，103-104.
4林万明.PCR技术操作和临床应用指南.北京：人民军医出版社，1995.35-38.
5Jacobs M, Brule A, Snijders P, et al. A non-radiation PCR enzyme-immunoassay enables a rapid identification of HPV 16 and 18 in cervical scrapes after GP5+/6+ PCR. J Med Viral, 1996, 49: 223-223.
