二、核酸探针的标记和检测
分子杂交是核酸链以碱基配对规则的一种结合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子杂交这一特性来对特定核酸序列进行检测，必须将杂交链中的一条用某种可以检测的进行标记，这条链就称为核酸探针。因此，核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。放射性同位素标记是最早采用的也是目前最常用的核酸探针标记方法。常用的放射性同位素有32P和35S。32P因其能量高，信号强，所以最常用。放射性同位素标记探针虽然敏感度高，但却存在辐射危害和半衰期限制（32P半衰期为14.3天，35S半衰期为87.1天，125I半衰期为60天），3H的半衰期长达12.3年，但它所释放β射线的能量太低，只能用于组织原位杂交。由于同位素标记的探针在使用过程中存在着上述缺点，近年来，人们在寻找非放射性标记物方面取得了很大进展。国内已具备生物素类标记物的生产能力，并有相应试剂出售。目前非放射性标记物有下述几类：金属如Hg、荧光物质如F2TC、半抗原如地高辛、生物素、酶类如辣根过氧化物酶（HRP）、半乳糖苷酶或碱性磷酸酶（AKP）等，不同的标记物，所标记探针的方法及检测方法也各异。
核酸探针的常用酶促标记技术有：缺口平移；DNA快速末端标记；用T4多核苷酸酶标记DNa 5'末端，随引物延伸；聚合酶链反应。
核酸探针的非放射性标记技术有：光促生物素标记核酸、酶促生物素标记核酸、寡核苷酸的生物素末端标记、酶标DNA、酶标寡核苷酸、DNA半抗原标记。
三、核酸分子杂交方法
随着基因工程技术的发展，新的核酸分子杂交技术不断出现和完善，核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸链游离在溶液中，固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。
在固相杂交中，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，所以比较常用。常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。
液相杂交是一种研究最早且操作简便的杂交类型，由于液相杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高，所以不如固相杂交那样普遍。近几年由于杂交检测技术的不断改进，商业性基因探针诊断盒的实际应用，推动了液相杂交技术的迅速发展，下面对固相杂交和液相杂交分别进行介绍。
（一）固相膜核酸分子杂交方法。
固相核酸杂交多是在膜上进行，因此，以下主要介绍固相膜的核酸分子杂交方法。
1．DNA的变性解链是杂交成功的关键,Southern印迹杂交时DNA在凝胶中变性,变性方法是将凝胶浸在数倍体积的1.5mol/l NaCl和0.5mol/L NaOH中1小时，然后用数倍体积的1mol/L Tris-HCl （pH8.0）和1.5mol/L NaCl溶液中和1小时。DNA受酸、碱、热等处理均能发生变性，但强酸会使核酸降解。碱变性可避免DNA的降解、热变性要在低DNA浓度（100μg/ml）和低盐浓度（0.1SSC 15mmol/L NaOH，1.5mmol/L柠檬酸三钠，pH7.0)下进行。用SSC稀释DNA溶液为50μg/ml，加10mol/l NaOH使最终浓度为0.1mol/L（pH约12.8），室温变性10min，很快置冰盐水中，用10mol/l HC1或5mol/L NaH2PO4调pH到7-8(亦可用碱变性后，调至中性，再加热100℃后，调至中性，或只加热100℃10min)。DNA变性可用OD260增加（约30-40%）来检测，变性DNA醇沉淀呈雪样，完全失去纤维状沉淀。变性后加入等量冷的12×SSC，冰溶保存。
2．变性DNA在硝酸纤维素膜上的固定。硝酸纤维素滤膜（孔径0.45um）先在蒸馏水中充分浸泡，再用6SSC浸泡30min～2h，凉干，DNA样品转移或加至硝酸纤维素膜上后，先室温干燥4h，然后再在80℃真空干燥2h。
3．预杂交。湿润的滤膜放入可加热封口的塑料袋中，按每平方厘米膜加0.2ml预热至60℃的预杂交液（6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt液，100μg/ml鲑鱼精DNA）。鲑鱼精DNA需经过剪切和DNA酶消化处理，然后酒精沉淀纯化，调浓度至10μg/ml，用前放100℃水溶液中煮沸变性10min，冰水骤冷。尽可能将袋中气泡赶尽，用封口器将袋口封住。将杂交袋浸入68℃水浴中保温3-12h，当预杂交液温度升至68℃时，在滤膜表面常会形成水气泡，轻轻晃动袋中液体即可除去这些小气泡，这一点对于保证滤膜表面充分浸润预杂交液很重要。
4．杂交。 从水浴中取出塑料袋，用剪刀剪开一角，尽可能挤净预杂交液，用吸管或大枪头将杂交液加入袋中，用恰好足量的液体保持滤膜湿润（50ul/cm2）。溶液的组成是6×SSC，0.01mol/L EDTA，变性的标记核酸探针，5×Denhardt液，0.5%SDS，100mg/ml变性的鲑鱼精DNA。尽可能赶尽气泡后，将塑料袋严密封口。杂交反应在68℃水浴中进行，所需时间视探针和检测靶DNA的性质及探针的比活性等情况而定，一般为4-20h。
5．洗膜。取出塑料袋，用剪刀剪开，小心取出滤膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盘中,室温下漂洗5min,再将滤膜移入2×SSC和0.1% SDS中,室温下洗涤15分钟(轻轻摇动),然后将滤膜移入0.1%×SSC和0.5%×SDS溶液中,68℃轻轻摇动保温2h，更换缓冲液后继续保温30min。
洗脱的温度一般应控制在Tm值12℃以下，[Tm=69.3+0.41×(G+C）%]，双链DNA的Tm值随错配碱基对数每增加1%而递减1℃。
6．结果显示。放射性测定方法，固相膜的放射性杂交结果显示有两种方式，一是放射自显影法、另一是液闪计数法，放射自显影法比较简单，只需将杂交膜与X光片在暗盒中暴光数小时至数天，再显影，定影即可。对于杂交信号较强的固相膜，用一块增敏屏可显著增强暴光强度。此外，为了减弱32P的放射，暴光通常在-20℃或-80℃下进行。液闪计数法主要用于斑点和狭缝杂交及为了比较两个杂交信号的强弱等情形，方法是将完成杂交的膜在漂洗结束后剪成小块（每份样品1块），80℃真空干燥后装闪烁瓶，加入2—5ml闪烁液，剪2-3块无样品作为本底对照，在液体闪烁计数器上自动计数，液体计数测定放射性强度也可以在放射自显影之后进行。
(二)固相核酸分子杂交类型
1．菌落原位杂交（colony in situ hybridization）。是将细菌从一主平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释放出DNA，将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号、并与主平板上的菌落对位。
实验步骤如下：
①将硝酸纤维素滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相同。
②培养细菌至产生1-2mm大小的菌落。
③在一块平皿中置4张滤纸，用10%SDS浸透，倒掉多余液体，将带有菌落的滤膜取下轻轻置于滤纸上，菌落面在上，注意防止滤膜底面存有气泡。
④5min后，将滤膜转至用变性溶液（0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNaCl）浸湿的滤纸上，放置10min。
⑤将滤膜转至中和溶液（1.5mol/l NaCl, 0.5mol/L Tris-HCl pH8.0)浸湿的滤纸上，放置10min，重复中和一次。
⑥将滤膜移至用2×SSPE溶液浸过的滤纸上，放置10min，SSPE配成20×贮备液：3.6mol/l NaCl,0.2mol/L NaH2PO4(pH7.4)，20mmol/L EDTANa2（pH7.4)。
⑦将滤膜用滤纸吸干，80℃真空烘干2h。
2．斑点杂交（Dot blot）。是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析。一张膜上可同时检测多个样品，为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状。反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。
（1）DNA斑点杂交：
①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。
②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。
③用铅笔在滤膜上标好位置,将DNA点样于膜上,每个样品一般点5μl(2~10μg DNA)。
④将膜烘干，密封保存备用。
（2）RNA斑点杂交：与上法类似，每个样品至多加10μg总RNA（经酚/氯仿或异硫氰酸胍提取纯化），方法是将RNA溶于5μl DEPC水，加5μl甲醛/SSC缓冲液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA变性，然后取5-8μl点样于处理好的滤膜上，烘干。
（3）完整细胞斑点杂交：应用类似检测细菌菌落的方法，可以对细胞培养物的特异序列进行快速检测，将整个细胞点到膜上，经NaOH处理，使DNA暴露、变性和固定，再按常规方法进行杂交与检测。有人曾用此法从105个培养细胞中检测到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整细胞斑点印迹法可以用于筛选大量标本，因为它使细胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法还高，又不影响与32P标记的探针杂交，但它不适用于非放射性标记探针，因为DNA纯度不够，会产生高本底。
3.Southern印迹杂交（Southern blot）。是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和和高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着，附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置，从而可以确定在众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
（1）琼脂糖凝胶电泳。利用琼脂糖凝胶电泳可以很容易地将DNA限制酶消解片段（0.3～25kb）分离开，分离大分子DNA片段（800-12000bp）用低浓度琼脂糖（0.7%），分离小分子片段（500～1000bp）用高浓度琼脂糖（1.0%），300-5000bp的片段则用1.3%的琼脂糖凝胶。根据分离样品品质，分离速度和分辨率要求的不同，可选用不同规格的电泳槽。
电泳时，同时将分子量标记物加到旁边孔中，便于确定样品DNA的分子量。20伏恒压电泳过夜，电泳完毕，将胶浸到含0.5μg/ml EB的TBE缓冲液中染色30min，也可将EB直接加到电泳缓冲液中或在灌胶前加入胶片中，在254nm短波透射灯下拍照，加橙黄色滤色镜，使用高速一次成像胶片，光圈f4.5，曝光20-40s。
（2）硝酸纤维素膜吸印。
[1]将胶片切成合适大小，切去右上角作为记号。
[2]将胶片放进盛有变性缓冲液（1.5mol/l NaCl,0.5mol/L NaOH）的盘中轻晃15min。
[3]换到中和缓冲液（1mol/l Tris-HCl,pH8.0,0.15mol/L NaOH）的盘中轻晃30min。
[4]裁一张硝酸纤维素膜、2-4张3mm滤纸和一些吸印纸（可用卫生纸），都与胶的大小相同（硝酸纤维素膜和吸印纸不能比胶大，否则易形成旁路）。先将硝酸纤维素膜浸到水中，再放入10×SSC缓冲液,接触胶和硝酸纤维素膜时都要戴手套操作。
[5]平盘上放一块比胶大的平板上面铺一张3mm滤纸,起灯蕊作用,盘中加入少量10×SSC缓冲液（2.5cm厚），不能没过平板，使3mm滤纸充分饱和。
[6]将胶倒扣在3mm滤纸上。
[7]浸湿的硝酸纤维素膜在胶上，对齐。铺膜时从一边逐渐放下，防止产生气泡，有气泡时，可用吸管赶出，不能让膜与胶下的滤纸直接接触。
[8]膜上放一张3mm滤纸，不能与胶接触。
[9]上面加吸印纸及重物（500g左右）。
[10]通过滤纸的灯芯作用，平盘中的缓冲液就会通过胶上移，从而将DNA吸印到膜上，及时更换浸湿的吸印纸，在室温下转印过夜。
[11]清除上面的东西。用镊子将膜取出，在6×SSC中洗一下。
[12]自然干燥，80℃烤2h。
[13]这是的膜就可进行杂交，或室温密封保存。
