中华医学检验杂志 2000年第6期第23卷 论著 作者：孔庆莲 于秀娟 姚苹
单位：孔庆莲 于秀娟（山东医科大学第一附属医院检验科 济南，250012）；姚苹（山东医科大学公共卫生学院）
【摘要】 目的 选择适用于检测产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)临床大肠埃希菌、肺炎克雷伯耐药菌株的最佳方案。方法 临床分离的110株大肠埃希菌和84株肺炎克雷伯菌经初筛试验，用浓度梯度法（Etest法）、单纸片加抑制剂克拉维酸和单纸片加抑制剂舒巴坦扩散法、阿莫西林及氨苄西林双纸片协同试验，比较5种方法的检出率及其差异。结果 Etest法对产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的检出存在明显的差异（P＜0.01)，肺炎克雷伯菌的检出率(4/20)明显低于大肠埃希菌(16/26)；单纸片扩散法加克拉维酸对两种菌的检出均较高(16/26、12/20)。检测产ESBLs大肠埃希菌时，除氨苄西林双纸片协同法(8/26)检出率低以外，其他4种方法的检出率无明显差异（P＞0.05)，5种方法有较好的一致性。检测产ESBLs肺炎克雷伯菌时，单纸片扩散法加克拉维酸或舒巴坦(12/20)与Etest法、氨苄西林双纸片协同法的检出(4/20)存在差异（P＜0.05)，前两种方法检出率较高。结论 单纸片扩散法应为临床检测ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的首选方法。
Detecting extended-spectrum beta-lactamases in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae
KONG Qinglian YU Xiujuan YAO Ping
（Laboratory of Microbiology, First Hospital of Shandong Medical University, Jinan 250012, China）
【Abstract】 Objective To detect ESBLs in E.coli and K.pneumoniae with appropriate method.Methods The suspiciously produced ESBLs were detected by standard screen test among 110 E.coli and 84 K.pneumoniae. ESBLs possessing strains were confirmed by E test, single-disc diffusion test with clavulanic acid or sulbatan, and two kinds of double-disc synergy test. Results There was a significant difference between the detected rate of ESBLs in E.coli (16/26) and K. pneumoniae (4/20) by E test（P＜0.01). The detected rate of K. pneumoniae was lower than that of E.coli. The single-disc diffusion with clavulanic acid showed no difference in the detected rate of ESBLs E.coli (16/26) and K. pneumoniae (12/20). Except one kind of double-disc synergy test (8/26), other methods showed no difference for the detected ESBLs in E.coli（P＞0.05). The single-disc diffusion test with clavulanic acid or sulbatan was applicable to confirm ESBLs in K. pneumoniae (12/20). Conclusions Single-disc diffusion test is a sensitive, convenient and inexpensive method to confirm ESBLs in E.coli and K.pneumoniae in clinical laboratory.
【Key words】 beta-lactamases; Esccherichia coli; Klebsiella pneumoniae
由于β-内酰胺类抗生素的广泛应用及不合理使用，耐药菌株迅速增加。耐药菌株产生的超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）能水解几乎所有的β-内酰胺酶类和单酰胺类抗生素，给临床治疗带来极大困难。ESBLs可通过多种形式进行耐药性的扩散［1］，能造成严重的医院暴发性感染和院外耐药菌株的传播［2，3］，因此对产ESBLs菌株的检测极为重要。目前临床有多种产ESBLs菌株的检测方法［1，4，5］，对检出率的报道差异很大。为选择适合临床的最为理想的检测方法，我们采用浓度梯度法(Etest法)、两种单纸片扩散法及两种双纸片三底物协同扩散法，对产ESBLs菌株的检测效果进行比较。
材料与方法
一、材料
1.标本来源：分离菌株均来自我院临床送检的血、尿、痰等标本。其中大肠埃希菌110株，肺炎克雷伯菌84株。
2.标准菌株：大肠埃希菌ATCC25922由中国生
表1 26株疑产ESBLs大肠埃希菌确证试验结果
| 菌株
编号 |
双纸片扩散法 | 单纸片扩散法 | |||||||||||
| 阿莫西林+克拉维酸 | 氨苄西林+舒巴坦 | 克拉维酸 | 舒巴坦 |
Etest法 |
|||||||||
| CTX | CAZ | AZT | CTX | CAZ | AZT | CTX | CAZ | CTX | CAZ | CAZ | CAZ+C | MIC比值 | |
|
2 |
± | ＋ | ＋ | - | ＋ | - | ≥5 | ≥5 | ≥5 | ＜5 |
0.5 |
0.094 |
5.3 |
| 3 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | 0.5 | 0.125 | 4 |
| 5 | ＋ | - | ± | - | - | - | ≥5 | ≥5 | ≥5 | ＜5 | 1.0 | 0.19 | 5.2 |
| 13 | - | - | - | - | ＋ | ＋ | ＜5 | ≥5 | ＜5 | ＜5 | 32 | 0.5 | 64 |
| 19 | ± | - | ＋ | - | - | - | ＜5 | ≥5 | ＜5 | ≥5 | 6 | 0.25 | 24 |
| 21 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜0.5 | 0.125 |
- |
| 24 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | - | ≥5 | ＜5 | ≥5 | ＜5 | 0.75 | 0.125 | 6 |
| 25 | ＋ | - | ± | - | - | - | ≥5 | ≥5 | ≥5 | ＜5 | 2 | 0.38 | 5.2 |
| 32 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | 0.5 | 0.19 | 2.6 |
| 41 | ＋ | - | ＋ | ＋ | - | - | ≥5 | ≥5 | ≥5 | ≥5 | 32 | 0.38 | 84 |
| 57 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | 0.75 | 0.19 | 3.9 |
| 58 | ± | - | ＋ | - | - | - | ＜5 | ≥5 | ＜5 | ≥5 | 4 | 0.38 | 10.5 |
| 60 | ＋ | ＋ | ＋ | - | ＋ | - | ≥5 | ≥5 | ≥5 | ＜5 | 0.5 | 0.094 | 5.3 |
| 61 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | 0.75 | 0.38 | 1.9 |
| 62 | ＋ | - | ± | - | - | - | ≥5 | ≥5 | ≥5 | ≥5 | 32 | 0.28 | 114 |
| 67 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | 0.5 | 0.125 | 4 |
| 70 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | 0.5 | 0.5 | 1 |
| 71 | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ＋ | ≥5 | ＜5 | ≥5 | ＜5 | 0.75 | 0.125 | 6 |
| 79 | - | - | - | ＋ | ＋ | ＋ | ＜5 | ≥5 | ＜5 | ＜5 | 16 | 0.5 | 32 |
| 83 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜0.5 | 0.125 |
- |
| 86 | ± | ＋ | ＋ | - | - | - | ≥5 | ≥5 | ≥5 | ＜5 | 0.75 | 0.094 | 7.9 |
| 90 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | 1.0 | 0.25 | 4 |
| 93 | ＋ | - | ＋ | - | - | - | ≥5 | ≥5 | ≥5 | ≥5 | 7.4 | 0.18 | 63 |
| 97 | ± | - | ＋ | - | ＋ | - | ≥5 | ≥5 | ≥5 | ＜5 | 0.5 | 0.094 | 5.3 |
| 101 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | 0.5 | 0.19 | 2.6 |
| 108 | ＋ | ＋ | ＋ | - | - | - | ≥5 | ≥5 | ≥5 | ＜5 | 16 | 0.25 | 64 |
| 阳性 | 9 | 6 | 11 | 4 | 6 | 3 | 12 | 14 | 12 | 5 | 16 | ||
| 合计 | 14 | 8 | 16 | 14 | 16 | ||||||||
±：可疑阳性物制品鉴定所提供。 3.用于检测产ESBLs菌的Etest法纸条购于倍肯公司，底物为头孢他啶（CAZ），MIC刻度范围：头孢他啶0.5～32（0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，12.0，16.0，24.0，32.0）μg/片，头孢他啶+克拉维酸(CAZ +C) 0.064～4（0.064，0.094，0.125，0.19，0.25，0.38，0.5，0.75，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0）μg/片。药敏纸片头孢他啶（CAZ）30 μg/片，头孢塞肟（CTX）30 μg/片，氨曲南（AZT）30 μg/片，阿莫西林20 μg+克拉维酸10 μg/片，氨苄西林10 μg+舒巴坦10 μg/片，均购自北京天坛药物生物技术开发公司。
4.抑制剂：克拉维酸由南京药厂提供，舒巴坦由深圳药厂提供。
5.MHA琼脂培养基购自杭州天和微生物试剂有限公司。
二、方法
1.初步筛选试验：取MHA琼脂培养基接种临床分离纯化菌株，选用CAZ、CTX、AZT按标准纸片扩散法进行操作，35℃培养18～24 h。抑菌环以CAZ≤22 mm、CTX≤27 mm、AZT≤27 mm为高度怀疑的ESBLs菌株。质控标准大肠埃希菌ATCC25922作阴性对照，抑菌环为CAZ 25～32 mm、CTX 29～35 mm、AZT 28～36 mm。
2.Etest法：培养基及培养条件同初步筛选实验，方法按说明书操作。结果判定：头孢他啶与头孢他啶+克拉维酸MIC刻度比值＞5为产ESBLs阳性，≤5为阴性。
3.单纸片扩散法：单纸片加抑制剂克拉维酸扩散法：取MHA琼脂培养基接种临床分离纯化菌株，选用CAZ、CTX和AZT纸片，并另外在3种纸片上分别加克拉维酸10 μg，采用标准纸片扩散法，35℃培养18～24 h。分别测定3种纸片单独和加克拉维酸
表2 20株疑产ESBLs肺炎克雷伯菌确证试验结果
| 菌株
编号 |
双纸片扩散法 | 单纸片扩散法 | |||||||||||
| 阿莫西林+克拉维酸 | 氨苄西林+舒巴坦 | 克拉维酸 | 舒巴坦 |
Etest法 |
|||||||||
| CTX | CAZ | AZT | CTX | CAZ | AZT | CTX | CAZ | CTX | CAZ | CAZ | CAZ+C | MIC比值 | |
|
5 |
- | - | ＋ | - | - | - |
＜5 |
≥5 |
≥5 |
＜5 |
＜0.500 |
0.125 |
- |
| 6 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ≥5 | ＜5 | ≥5 | 0.000 | 0.000 |
- |
| 8 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | 0.500 | 0.125 |
4.000 |
| 10 | ＋ | ＋ | ＋ | - | ± | ＋ | ≥5 | ≥5 | ≥5 | ＜5 | 2.000 | 0.250 | 8.000 |
| 20 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | 0.750 | 0.500 | 1.500 |
| 23 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | 0.500 | 0.190 | 2.600 |
| 36 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | 0.500 | 0.750 | 0.660 |
| 40 | ＋ | - | ＋ | ＋ | - | - | ≥5 | ＜5 | ≥5 | ＜5 | 0.750 | 0.190 | 3.940 |
| 42 | ＋ | ＋ | ＋ | - | - | - | ≥5 | ≥5 | ≥5 | ≥5 | 8.000 | 1.500 | 5.300 |
| 46 | - | - | - | - | - | - | ≥5 | ≥5 | ≥5 | ≥5 | 0.000 | 0.000 |
- |
| 50 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | 0.500 | 0.190 | 2.630 |
| 53 | ＋ | - | ＋ | ＋ | - | - | ≥5 | ＜5 | ≥5 | ＜5 | 1.000 | 0.280 | 3.500 |
| 56 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | 0.750 | 0.190 | 3.900 |
| 62 | - | - | - | - | - | - | ≥5 | ≥5 | ≥5 | ≥5 | 0.000 | 0.000 |
- |
| 68 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ≥5 | ＜5 | ≥5 | 0.000 | 0.000 |
- |
| 71 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜0.50 | 0.125 |
- |
| 77 | - | - | ＋ | - | - | - | ＜5 | ≥5 | ≥5 | ＜5 | 0.500 | 0.125 | 4.000 |
| 78 | ＋ | ＋ | ＋ | - | ＋ | ＋ | ≥5 | ≥5 | ≥5 | ＜5 | 1.500 | 0.250 | 6.000 |
| 80 | ＋ | - | ＋ | - | - | - | ≥5 | ≥5 | ≥5 | ≥5 | 2.000 | 0.380 | 5.260 |
| 83 | - | - | - | - | - | - | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜5 | ＜0.500 | 0.125 |
- |
|
阳性 |
6 | 3 | 8 | 2 | 1 | 2 | 8 | 10 | 10 | 6 | 4.000 | ||
| 合计 | 8 | 4 | 12 | 12 | 4.000 | ||||||||
的抑菌环直径，加克拉维酸和不加克拉维酸的抑菌环直径之差≥5 mm，即确认为ESBLs菌株。质控标准大肠埃希菌ATCC25922结果之差≤2 mm。单纸片加抑制剂舒巴坦扩散法：选用CAZ、CTX和AZT纸片，并另外在3种纸片上分别加舒巴坦10 μg，培养条件、方法及结果判断同单纸片加抑制剂克拉维酸扩散法。
4.双纸片扩散法：阿莫西林双纸片协同扩散法：培养接种方法同单纸片扩散法。阿莫西林纸片贴于平皿中央。 周围分别贴CAZ、CTX和AZT纸片，每种纸片与中央纸片分别选取 15mm和20 mm两种间距。结果以周围纸片与中央纸片间出现协同抑菌环为ESBLs菌株。氨苄西林双纸片协同扩散法：氨苄西林纸片贴于平皿中央。其余条件、方法及结果判断同阿莫西林双纸片协同扩散法。
结果
1.初步筛选试验：110株大肠埃希菌可疑产ESBLs菌26株，84株肺炎克雷伯菌可疑产ESBLs菌20株（表3）。
2.不同检测方法对产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌检出的比较：见表1～3。
表3 产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌检出的比较(阳性例数)
| 方 法 | 产ESBLs | |
| 大肠埃希菌 | 肺炎克雷伯菌 | |
| ESBLs初筛试验 |
26/110 |
20/84 |
| Etest法 | 16/26 | 4/20 |
| 单纸片扩散法加克拉维酸 | 16/26 | 12/20 |
| 单纸片扩散法加舒巴坦 | 14/26 | 12/20 |
| 阿莫西林双纸片协同法 | 14/26 | 8/20 |
| 氨苄西林双纸片协同法 | 8/26 | 4/20 |
3.5种确证检测方法对产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌检出的差异性 Etest法对产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的检出差异有非常显著性，确切概率法P＜0.01，对后者的检出率明显低于前者。单纸片扩散法加克拉维酸对两种菌的检出无差异，且有较好的一致性。其余方法对两种菌的检出率也无明显差异。
4.5种确证检测方法对产ESBLs大肠埃希菌检出的相互比较。统计学检验表明在检测产ESBLs大肠埃希菌时，5种方法除氨苄西林双纸片协同法检出率低以外，其他4种方法的检出率差异无显著性意义（P＞0.05)，5种方法在检测产ESBLs大肠埃希菌时有较好的一致性。
5.5种确证检测方法对产ESBLs肺炎克雷伯菌检出的相互比较：检测产ESBLs肺炎克雷伯菌时，单纸片扩散法加克拉维酸或舒巴坦与Etest法、氨苄西林双纸片协同法检出率存在差异（P＜0.05)，并且前两种方法与后两种方法在检测产ESBLs肺炎克雷伯菌时存在不一致性。
讨论
耐药菌株产生的ESBL及ESBLs主要是TEM类和SHV类，迄今为止TEM类ESBLs已增加到TEM-52，SHV也由SHV-2增加到SHV-24，目前临床实验室还在不断地发现新的TEM类和SHV类ESBLs，这给临床检测不断出现的新的耐药菌株带来巨大的挑战，也要求临床有对ESBLs耐药菌株灵敏、特异、稳定、易行的检测方法。
本试验对目前临床已采用的5种检测ESBLs耐药菌株的确证试验方法进行比较，表明5种方法对产ESBLs大肠埃希菌平均检出有较好的一致性，但氨苄西林双纸片协同法检出率低于其他4种方法。检测产ESBLs肺炎克雷伯菌时，单纸片扩散法加克拉维酸或舒巴坦检出率高于Etest法和氨苄西林双纸片协同法。经多次重复试验显示，在检测ESBLs肺炎克雷伯菌时Etest法检出率明显低于单纸片扩散法和阿莫西林双纸片协同法，这可能与目前用于临床检测产ESBLs细菌Etest纸条的单一底物有一定关系，也可能与临床分离的肺炎克雷伯不同菌株对抗生素所产生的耐药性酶的种类及产酶量有关。
为了提高耐药菌株的检出率及增加试验结果的稳定性，我们建议首选单纸片扩散法加克拉维酸的表型确证试验，并严格遵循克拉维酸现配现用的原则，这与许多试验结果及试验要求相吻合［6，7］。
参考文献
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2，Palucha A, Mikiewicz B, Gniadkowski M .Diversification of Escherichia coli expressing an SHV-type extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) during a hospital outbreak: emergence of an ESBL-hyperproducing strain resistant to expanded-spectrum cephalosporins. Antimicrob Agents Chemother, 1999, 43:393-396.
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