马筱玲 李庆 翟志敏
（合肥 安徽省立医院检验科 230001）
Measure MICs of antibiotic by Flow Cytometry
Ma Xiaoling，Li Qing，Zhai Zhimin Department of Clinical Laboratory of AnHui Province Hospital，Hefei 230001，China
Objectives：A rapid method for measuring antibiotic minimal inhibitory concentrations （MICs） by Flow cytometry （FCM） was develop and its application value was studied by comparing with the conventional method.
Methods：20 strains of Enterbacteriaceae were taken and fluorescence labeled by propidium iodide （PI），mean fluorescence intensity （MFI） of nagative control and reaction tube for durg MIC was read respectively. According to the judgement level of MIC by flow cytometry susceptibility testing （FCST） ，28 clinical isolates were double－blind examined at the same time by conventional method and FCST.
Results：The mean of MFI for 20 bacteria was 2.07，and the coefficient of variation was 0.31； The MIC was defined as the lowest concentration of drug that showed an increase of 100％ in MFI compared to that of the negative control. Comparing the MICs of FCST and conventional method for 28 clinical bacteria，we found the correlation coefficient was 0.92 ，P values of <0.001，were considered highly significant，the regression equation is y＝1.4x－0.48.
Conclusion：The correlation of results for FCST and conventional method was notable，and FCST is rapid，accurate，stabile and convenient for automatization，which has a good clinical application foreg－ round.
Key word：Flow cytimetry（FCM） Minimal inhibitory concentration（MIC） Mean fluorescence intensity（MFI）
抗生素最低抑菌浓度检测（MIC）是判断细菌对抗生素敏感性的重要标志，是临床合理使用抗生素的依据，传统的检测方法操作烦琐、耗时较长，不利于及时有效地指导感染性疾病的治疗。近年来，流式细胞术以其能够快速、大量对细胞（或微粒）的生物学性状及功能状态进行定性或定量检测而广泛应用于临床检验的多个领域，但在细菌体外抗生素敏感试验方面的研究目前国内报道甚少[1，2，3]，本文建立一种流式细胞术（FCM）快速检测MIC的方法并与常规药敏试验结果进行比较，探讨其应用价值。
材料和方法
一、材料
1、菌株：大肠埃希菌标准菌株ATCC25922购自中国药品生物制品检定所。临床菌株共47株，为安徽省立医院细菌室分离菌株，经VITEK全自动微生物分析仪鉴定，其中大肠埃希菌27株，阴沟肠杆菌5株，肺炎克雷伯菌4株，雷氏普鲁威登菌1株，粘质沙雷菌4株，摩氏摩根菌1株，奇异变形杆菌4株，产气肠杆菌2株。
2、试剂：注射用头孢噻肟钠由珠海联邦制药厂生产，用无菌蒸溜水配置成1280?g/ml母液，分装，－20℃保存，备用；碘化丙啶（PI）干粉由美国Sigma公司生产，用磷酸盐缓冲液配置成1000?g/ml，备用。磷酸盐缓冲液由a液（无水磷酸氢二钠9.465g，加水至1000ml，溶解）和b液（磷酸二氢钾9.073g，加水至1000ml，溶解）以体积4：1混合制得，其pH为7.4。
3、仪器：XL－MCL型流式细胞仪由美国BECKMAN－COULTER公司生产，每次试验前用质控荧光微球对仪器进行光路和流路监测，保证仪器处于正常工作状态。
二、方法
1、常规药敏试验：采用微量稀释法[4]，将头孢噻肟用MH肉汤作一系列倍比稀释，浓度为0.03～128?g/ml，取每个浓度稀释液各100?l加入微孔板，再将待测细菌配置成106CFU/ml菌液，每孔接种100?l，最终头孢噻肟稀释浓度为0.015～64?g/ml，接种菌量为5×105CFU/ml，混匀，置湿盒中，35℃孵育16～20h，以无肉眼可见细菌生长的最低药物浓度为头孢噻肟对该菌的最小抑菌浓度（MIC）。
2、流式细胞术药敏试验（Flow Cytometry Susceptibility testing，FCST）：无菌操作配置药物及菌液，方法同常规药敏试验，最终头孢噻肟稀释浓度为0.015～64?g/ml，接种菌量为5?106CFU/ml（比常规药敏试验菌液浓度增加10倍），混匀，置湿盒中，35℃孵育90min，取495?l培养液加5?lPI染液，最终PI标记浓度为10?g/ml（该浓度的确定依据预试验结果[5]），于4℃冰箱染色10min，上机检测。检测前用清洗液冲洗流路，并用无菌蒸馏水上机测试，每秒钟测得颗粒数小于2即可进行试验。试验使用的技术参数为：前散射光（FS LOG）电压为220V，增益（GAIN）2.0；侧散射光（SS LOG）电压为21V，增益（GAIN）50.0；碘化丙啶荧光（FL3 LOG）电压为683V，增益（GAIN）1.0；方案一经确立，在所有的检测中保持不变。试验计数10000个细菌，用Listmode软件程序进行数据分析，从前散射光/碘化丙啶荧光（Forward angle light scatter/PI fluorescence，FS/FL3）双参数图（见图1，2）上设定G门表示总体被测细菌，F门表示PI染色高荧光强度细菌，计算G门平均荧光强度（Mean fluorescence intensity，MFI）作为观察指标。
3、流式细胞术MIC判断值的设定和验证：取标准菌株和临床菌株共20株，分别检测不加抗生素阴性对照管细菌总体的MFI（A）和常规药敏MIC抗生素浓度作用管细菌总体的MFI（B），以B/A为MFI增加比值，计算其比值均数，设定MIC判断值。根据其判断值，用28株临床菌株进行验证，比较常规药敏试验和流式细胞术药敏试验MIC检测结果间的相关性。
结 果
1、不同生活状态细菌流式细胞仪检测结果：取不加抗生素正常生长的细菌作为阴性对照，用75％乙醇处理1h的细菌作为阳性对照，配置成5?106CFU/ml菌液，用PI染色，上机检测，结果如图1。
2、不同浓度抗生素对细菌生活状态的影响：取标准菌株、耐药菌株和敏感菌株分别配置成5×106CFU/ml菌液，用不同浓度头孢噻肟作用90min后，PI染色，上流式细胞仪检测，结果如图2、3。
3、流式细胞术药敏试验MIC判断值的设定：按上述方法对1株标准菌株和19株临床菌株分别检测不加抗生素阴性对照细菌和已知MIC浓度抗生素作用细菌的MFI，计算两者比值，求得比值均数为2.07，CV为0.31；据此结果，将测定管MFI值大于活细菌对照细菌2倍（增加100％）的最低药物浓度定义为该菌的MIC。
4、常规药敏试验与流式细胞药敏试验结果比较：取28株临床分离菌株用常规方法和FCST双盲法分别检测MIC，结果如表1，经直线回归分析，结果r＝0.92，（P<0.001），回归方程为：Y＝1.4X－0.48。回归直线见图4。
讨 论
抗生素体外药敏试验是临床合理进行抗感染治疗的重要依据，传统检测方法最大的缺点是耗时较长，通常需要20h，而真菌、结核分枝杆菌等慢生长细菌则需要1周、1月，甚至更长时间。自1973年第一台商业化的流式细胞仪问世，FCM已被用于细胞研究的各个方面，同样也用于细菌检测，使微生物实验室的传统检测模式发生了革命性的改变，在国外FCM甚至已被建议作为细菌常规药敏试验[6]，而在国内该项研究则刚刚起步，本试验旨在建立一种流式细胞术快速检测细菌MIC的方法并与常规药敏试验结果进行比较，探讨其应用价值。
FCM进行细菌药敏试验的原理是通过使用不同的荧光染料染色，根据所检测到的荧光强度的变化来判断细菌经抗生素处理后的存活状态，进而推断MIC。常用的FCST荧光染料分为膜渗透性、膜非渗透性和膜电位敏感性等三种，Ordonez等用膜电位敏感性探针DiOC5（3）检测金黄色葡萄球菌对青霉素和苯唑西林的敏感性，90min可获得药敏结果；Nordens等用膜渗透性染料FDA（荧光素二醋酸酯）染色做结核分枝杆菌药敏试验，24h可获得结果[7]；Wenisch等用膜渗透性染料FUN－1研究氟康唑的抗真菌活菌，其测得MIC值有83％与NCCLS的M27－T肉汤稀释法所测得的MIC值相同或仅相差1个稀释度，并且2～4h可获得结果[8]。本试验采用PI为荧光染料，该染料是FCM检测最常用的荧光染料，价格较低，为膜非渗透性荧光染料，即染料的分子量较大，不能进入细胞膜完整的细菌体内，只有当某种因素使细胞外膜完整性破坏后，染料方可渗入细胞内，嵌入到 DNA 的碱基对中并与之结合，表现为荧光强度明显增强。图1所示，经75％乙醇处理的细菌染色后FCM检测的MFI明显高于阴性对照细菌；图2、3所示，敏感细菌与抗生素作用后MFI增强，并且在一定范围内与抗生素作用浓度有正相关性，但当抗生素浓度过高，远远超过细菌的MIC时，MFI不再增加，考虑为大多数敏感细菌被裂解，变成细胞碎片，使F门内细菌总量明显减少所致；耐药性细菌因不受抗生素影响，MFI无明显改变。
FCST中MIC判断值的设定受细菌种类、荧光素种类、培养时间等因素影响较大，各文献报道不一。Ramani R和Chaturvedi V等在用FCM进行真菌药敏研究中，将与阴性对照相比MFI增加50％的最低药物浓度定义为该菌MIC[9]。本文选用20株肠杆菌科细菌进行试验，抗生素孵育时间为90min，分别检测阴性对照细菌及MIC抗生素浓度作用细菌的MFI，发现两者的比值基本恒定，（X：2.07 CV：0.31）。因而将MFI大于阴性对照细菌2倍（增加100％）的最低药物浓度定义为该菌的MIC。依据此判断标准我们对28株临床菌株进行常规药敏和FCST双盲检测，结果如表2，经回归分析，发现两者结果有显著相关性：r＝0.92，P<0.001，回归方程为：Y＝1.4X－0.48，回归直线见图4。
FCST不依赖细菌大量繁殖，大大缩短了试验时间，并且结果不受抗生素诱导耐药的影响。试验中采集10000个细胞，对每个细胞进行逐个分选、检测，了解细菌的存活状态，结果更加精确、稳定、受人为因素影响较小，便于自动化和标准化，唯一的不足是需要特殊仪器。但是近年来流式细胞技术已被广泛应用于多种检验仪器中，如五分类血液分析仪，尿沉渣分析仪等。相信该技术在快速细菌药敏试验方面的应用也将会引起广大学者和商家的浓厚兴趣，它的使用必将给传统的微生物检验方法带来令人兴奋的变革。
参考文献
1. 王建中，王淑娟. 当前临床流式细胞分析的发展趋势. 中华检验医学杂志，2002，25（1）：5－7．
2. 孙芾. 再谈流式细胞术广泛应用. 中华检验医学杂志，2002，25（1）：61－62．
3. 陈珊珊. 流式细胞术用于临床检验中的一些问题. 中华检验医学杂志，2000，23（4）：197－198．
4. National Committee for Clinical Laboratory Standards ．Performance standards for antimicrobial suscep－tibility testing. Ninth informational supplement. NCCLS，17（2）： 13. 1997．
5. 李庆，马筱玲，翟志敏等. 流式细胞术检测药物抗菌效应方法学的建立. 安徽医学，2003，24（3）：8－10．
6. Steen H.B. Flow cytometry of bacteria： glimpses form the past with a view to the future. J Microbiol Me－thods，2000 ，42（1）： 65－74．
7. Norden M A，Kurzynski T A，Bownds S E，et al. Rapid susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis
（H37Ra） by flow cytometry. J Clin Microbiol，1995； 33（5）： 1231－1237．
8. Wenisch C，Moore C B，Krause R，et al. Antifungal susceptibility testing of fluconazole by flow cytometry correlates with clinal outcome. J Clin Microbiol，2001； 39（7）： 2458－2462．
9. Ramani R，Chaturvedi V．Flow cytometry antifungal susceptibility testing of pathogenic yeasts other than Candida albicans and comparison with the NCCLS broth microdilution test． Antimicrob Agents Chemother，2000； 44（10）： 2752－2758．
说明：
（1）FCST中MIC判断值的设定受细菌种类、荧光素种类、培养时间等因素影响较大，阳性菌在FS/SS双参数图上的位置与阴性菌有差别，有文献报道阳性菌FCM法MIC判断标准与阴性菌也不相同，所以很难并于一文表述，目前，这方面研究正在进行中。
（2）在开始本论文工作之前，对FCST中的细菌浓度、溶媒的选择、PI浓度和染色时间等都进行了大量的预试验（论文已发表，见参考文献5），确立了最佳试验条件，并且每株细菌检测均设细菌生长对照管；以有效排除噪音干扰和作为荧光染料活性的质量控制措施。
摘 要目的：建立一种流式细胞术（FCM）快速检测抗生素最低抑菌浓度（MIC）的方法，与常规药敏试验结果进行比较，探讨其应用价值。
方法：取20株肠杆菌科细菌，用碘化丙啶（PI）染色，分别检测阴性对照管和MIC浓度抗生素作用管的平均荧光强度（MFI），计算两者比值，据此，设定流式细胞药敏试验（FCST）检测MIC的判断值，根据设定的判断值对28株临床分离细菌同时进行常规药敏和FCST双盲测定。
结果：20株肠杆菌科细菌测得的MFI比值x为2.07 ，CV为0.31；将MFI大于阴性对照细菌2倍（增加100％）的最低药物浓度定义为该菌的MIC，28株临床菌株FCST所测得的MIC与常规药敏试验相比r＝0.92，（P<0.001），回归方程为：Y＝1.4X－0.48。
结论：FCST与常规药敏试验结果有显著相关性，并且具有快速、稳定、准确，便于自动化等优点，有着较大的临床应用前景。
关键词：流式细胞术 最低抑菌浓度 平均荧光强度
