基因诊断杂志
丁肖华 何蕴韶
作者单位：510080 广州，中山大学中山医学院解剖学教研室
白血病是血液系统的恶性克隆性疾病，正确的诊断及分型对指导治疗至关重要。1976 年FAB分型方案是以形态学及细胞化学为基础的诊断分型方法。上世纪８０年代中期，随着多种生物医学科学技术的发展和应用，又逐渐形成了白血病的MIC(形态学、免疫学、细胞遗传学) 分型方案，几种方法互相结合互补，大大提高了诊断的准确性，为指导临床治疗和判断预后提供了宝贵的资料，但是临床诊断主要是依据骨髓形态学异常，核型变化和细胞周期的延长三者从不同侧面反映目前状态[1]。
1 目前常用的白血病检测方法
1.1 形态学检查
常规染色分类，同时进行细胞化学染色，包括髓过氧化物酶、糖原染色、A2醋酸奈酚酯酶及氟化钠抑制等试验。骨髓细胞形态学检查在血液病的诊断中有重要价值，可直接确诊各种类型白血病，并可发现多发性骨髓瘤、骨髓转移癌等[2]。根据骨髓细胞不同的增生度及形态变化提示贫血类疾病的病因诊断，如缺铁性、溶血性、再生障碍性贫血等[3]。但白血病细胞的高度异质性和多态性, 重复性差， 易受主观因素的影响，其诊断一致率约60%～80 %[4]。进一步的确诊往往需要进行细胞免疫学，遗传学和分子生物学等方法的检测。
1.2 免疫学检测
免疫学检测急性白血病微小残留病变（MRD）的主要方法有两种: 细胞涂片法和FCM。细胞涂片法所需设备简单，可在显微镜下清楚地判断细胞抗原和抗体结合的部位，尤其对细胞内抗原进行检测时较易排除因细胞膜渗透处理带来的非特异性反应，但目测不易对大量细胞进行计数，故敏感度较低，一般为10-2, 目前主要用于细胞内抗原的检测；而FCM 可同时对同一细胞中２个以上的抗原进行检测，并对大量细胞行快速分析，准确客观、简单方便。实验证明对其流动系统进行反复和长时间清洗后，检测MRD 可获得的最高敏感度是10-6, 但实际操作中一般达到的是10-4[5]。
MIC协作组认为细胞形态学对急性白血病诊断具有重要性,但更应该结合免疫学和细胞遗传学进行分析[6]。免疫分型是目前诊断白血病不可缺少的重要指标。近年来国际上公认和通用的方法是用流式细胞技术免疫分型[7]。流式细胞技术的基本原理, 就是让激光束照射高速流动的荧光标记的单细胞流, 激光的吸收和反射所产生的各种光学参数会被机器分析, 然后用图像表达出来。这些光学参数包括细胞的物理参数和各种荧光强度[8]。
1.3 细胞遗传学检测
取患者骨髓细胞,常规应用直接法或短期培养法进行染色体RHG 显带。分析细胞的染色体核型均是t(15 ;17) (q22 ;q21) 易位者为单纯型, 除t (15 ;17) 核型改变外, 还伴有其它核型异常者为复杂型[9]。染色体核型的检测不仅对AL的诊断有关，并且与治疗方案选择及预后有关。在60 %的急性髓细胞白血病(AML) 病人中有特异性染色体变化，如M2/ t (8 ; 21) 、M1/ t (9 ; 22) 、M4 EO/inv/ (16) 、M3/ t (15 ;17) 等, 这些特征性染色体异常也反映在对各种治疗的反应[4]。但是白血病细胞分裂指数低, 染色体形态短小, 常显带不清, 使得一些结构复杂或细微的改变难以准确识别[10]。
1.4 荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）
FISH技术灵敏度高，取材方便，骨髓或外周血均可作为研究对象，不仅对分裂中期细胞，而且对间期核细胞均能检测到，对隐匿型、变异型也可同样进行检测分析，是直观、敏感、快速、特异的诊断方法。FISH相关技术在白血病的染色体结构和数量畸变的分析与检测应用方面，已日趋完善。应用基因特异性探针，可检测大多数染色体重排、易位、倒位等结构改变[11]。但是，常用的双色单融合探针检测bcr/ abl 融合基因时,由于bcr 和abl 基因信号空间上的随机分布或光学重叠,可造成4 %～10 %的假阳性率[12，13 ] 。过高的假阳性率不仅影响到灵敏度与特异性,还可一定程度上影响研究者对实验结果的解释。
1.5 人血清铜蓝蛋白检测
血清铜蓝蛋白(Ceruloplasmin ,CP) 是一种急性期反应蛋白, 也是非特异性肿瘤发生的标志物, 其血清中含量在多种恶性肿瘤中均有明显增高。对血液系统疾病CP 水平测定及观察认为[14]: ①测定血清CP 水平对血液系统肿瘤的诊断及与非肿瘤性血液病的鉴别诊断有指导意义; ②测定淋巴瘤病人CP 水平对指导其分期及病情估价具有重要意义; ③测定CP 水平有助于估测白血病病人的肿瘤负荷及评价白血病的化疗效果。
1.6 端粒酶检测
端粒是真核细胞染色体末端( TTAGGG) n 重复序列结构, 对维持染色体的稳定具有重要作用。端粒的长短及稳定性决定细胞寿命,与细胞的衰老和癌变密切相关。端粒DNA 是由端粒酶控制合成的,端粒酶是RNA 依赖的DNA 聚合酶, 其激活是细胞获永生化及形成恶性肿瘤的一个重要步骤,已证明多种肿瘤细胞具有很高的端粒酶活性[15] 。端粒酶活性异常与白血病病变密切相关,可作为白血病细胞的标志物。据报道[16],白血病初诊期或复发期时具有较高的活性, 慢性粒细胞白血病急性变后, 端粒酶活性明显增高, 经治疗获缓解后活性明显降低, 结果与有关报告相符[17]。表明端粒酶作为白血病的标记物,可用于临床诊断。端粒酶活性为肿瘤细胞特有的标志物, 其存在代表有白血病细胞。
1.7 分子生物学检测
分子生物学检测较染色体检测更为灵敏、快速,不仅对白血病的诊断有用,而且更适用于对白血病微小残留病灶的检测。PCR方法敏感度相当高，但所需时间较长, 易受温度、 探针污染等因素影响, 尤其在AML-MRD 中的临床意义尚有争议,需要进一步研究证实〔18－20〕。在这里主要介绍两种PCR方法。
１．7.1 直接原位RT-PCR 这种方案更直接且容易实施,直接原位RT-PCR 检测慢粒bcr/ abl mRNA 具有特异性好，敏感度高[2１] ，且无须提取RNA 等优点。报道指出, 采用RT-PCR 检测bcr/ abl 融合基因较细胞遗传学方法提前5 个月发现复发[2２] 。因此, 应用RT-PCR 检测bcr/abl 融合基因动态监测MRD 可使患者得到更为精确的观察和随访,对临床治疗和预后十分有益。应用RT-PCR 检测bcr/abl 融合基因动态监测MRD 可使患者得到更为精确的观察和随访, 对临床治疗和预后十分有益。据报道[23]bcr/ abl 融合基因阳性的CML 患者预后较好,但ALL 患者正相反, bcr/ abl + ALL 往往呈现高危症状, 其完全缓解率低、 缓解时间及生存期短、早期耐药, 且缓解后复发率达100 %。 但由于引物错配和非特异性退火发生,容易产生非特异性结果[24] 。
1.7.2 荧光定量RT-PCR 方法 该方法灵敏、特异、重复性好,结果用拷贝数表示, 准确可靠, 利于统一标准。方法灵敏，重组质粒定量模板[2５]，按10倍梯度稀释，可检出10个拷贝，并由此制出标准曲线，线性范围宽(0～107 拷贝) ,方法的稳定性、重复性、相关性好，相关系数为0. 997。荧光定量RT-PCR 方法在CML 诊断、疗效和预后判断及MRD 的动态观察等方面有广泛的应用前景。由于几乎所有的CML 患者都能查出bcr/abl 融合基因，检测bcr/abl 融合基因有助于CML 的诊断，而且bcr/abl 融合基因阴转已成为CML疗效和预后判断的重要指标。
２ 启动子甲基化检测
２.1 基因组直接测序
测定经亚硫酸氢钠处理后的DNA序列是评估甲基化的金标准[2６]。这种技术可检出基因组DNA 中单个5’甲基胞嘧啶。这种方法的基础是亚硫酸氢钠能使单链DNA的胞嘧啶脱氨变成尿嘧啶。而5’甲基胞嘧啶则无变化。在CpG岛两端，设计PCR引物，其引物序列不含CpG二核苷酸。PCR 放大处理后的DNA片段，包括甲基化的和无甲基化的基因片段。但由于测序费用昂贵，不宜广泛的推广。
２.2 甲基化特异性PCR
Herman 等[2７]在其他实验室研究的基础上总结出甲基化特异性PCR(MSP) 方法, 其原理为: 双链DNA 变性解链后,在HSO3- 作用下发生C →U 转化, C 若已有甲基化则无此改变; 甲基化修饰只发生于5′→3′方向C-G相联结构的C 上,因此在HSO3- 作用后, DNA CpG岛若无甲基化,则序列中的改变为C →U, CG→UG,若有甲基化则为C →U ,CG→CG, 用不同的引物做PCR, 即可检测出这种差异, 从而确定基因有无CpG岛甲基化。从理论上说,DNA 发生甲基化的MSP 产物的序列与原序列比较,变化为C →T , CG→CG, 相应其互补链的改变无G→A, CG→CG, 本实验的测序结果与理论结果相符合, 证实了实验的可靠性。
MSP 是目前最敏感的技术，能发现0.1% 甲基化DNA(－50 pg)。可用于石蜡包埋组织。它的缺点是同其它PCR一样都存在定量问题。有时由于PCR 放大甲基化和非甲基化DNA 分子的效率不同，可出现PCR 偏性。然而，这些技术可应用于石蜡包埋组织和部分降解的DNA。通过设计针对已经亚硫酸氢钠转化DNA 序列的PCR 引物，可以避免由于不完全转化而导致的假阳性结果[2５]。
MSP 方法的建立为基因CpG岛甲基化研究提供了有效的方法。MSP 与普通PCR 的主要不同点在于对引物的设计有特殊要求,由于设计了甲基化引物M和非甲基化引物U, 两者中至少有一个有扩增, 否则即表明MSP 失败, 这样就无须设定内对照。此方法DNA 需要量极少、不需要有特异性酶切位点、无同位素污染、敏感度高、对标本要求不高, 陈旧标本,甚至蜡块均可使用。不过, 由于MSP 扩增产物中A 及T 比例非常高, 与普通PCR 相比, 扩增条件需做适当的调整。
２.3 荧光定量PCR
该方法灵敏、特异、重复性好, 结果用拷贝数表示, 准确可靠。实时定量检测不仅缩短了检测时间, 减少了污染的发生, 而且提高了分析数据的可靠性, 已被广泛应用于肿瘤学、遗传学及感染性疾病的基础研究与临床诊断。但在临床应用中, 对检测数据的阐释将受到多种因素的影响，包括不断更新的生化试剂在特异性和灵敏度方面的差异、不同平台间反应动力学的区别及实验对照与临界值的选择。因而各实验室应明确检测的临界值、设立正确的实验对照、规范标准操作与生化试剂以有助于室间比较。
２.3.1 非特异性检测 染料(如SYBR Green Ⅰ) 结合到双链DNA 上时能够产生很强的荧光信号。在PCR 过程中,当染料结合到合成的DNA 分子上时,产生的递增信号就会被实时检测。当扩增反应完成时, 通过缓慢加温双链DNA 解链, 结合其上的染料脱落导致信号下降从而被检测[28]。由于反应中每类DNA 都有其特征性融链过程,从而可以提高检测结果的可靠性。但其主要缺点在于染料非特异地结合双链DNA ,并不能区分引物二聚体及非特异性扩增产物,故应优化检测条件以降低扩增产物的非特异性。
２.3.2 特异性探针杂交系统 许多探针检测系统依赖于信号产生过程中荧光素介导的能量传递( FRET)。探针系统,如Taqman 探针、分子信标与ScorpionTM引物等,则依赖探针在游离状态下报告荧光基团与淬灭分子的接近使其荧光淬灭。当探针杂交到靶分子上时,由于杂交时的构型变化或Taq 聚合酶的5’核酸外切酶活性, 报告基团的荧光素游离出来产生信号的增加。
３ 启动子甲基化检测在临床中的应用
３.1 检测微小残留病变
白血病治疗失败的一个重要原因是复发，导致复发的一个重要因素就是微小残留灶的存在。一些基因甲基化仅出现在白血病细胞，而在正常细胞不存在甲基化， 这样就有可能作为白血病细胞的遗传标志。据报道[29]，急性白血病p15 CpG岛甲基化阳性率为80 % (40 例中有32 例), AML 与ALL 两型之间阳性率差异无统计学意义, 正常骨髓为阴性, 表明p15 CpG岛甲基化为白血病细胞所特有,白血病完全缓解期仍为阳性可能预示着复发(例数尚少, 需要进一步观察), p15 甲基化可以作为各型急性白血病通用的MRD 指标。
３.2 在临床诊断中的应用
已知脊椎动物基因组中基因5′端的Cp G岛甲基化状态能够调控基因的表达，几乎所有的看家基因和近一半的组织特异性表达基因的表达受Cp G 岛甲基化调控。一些基因的甲基化仅发生于特定类型的白血病，检测这些基因有助于白血病的临床分型。如：CEBPA基因， 编码转录因子CEBPа， 在粒细胞分化过程中起重要作用， 仅在AML-M2患者具有甲基化[30]。那么是否能找到一个基因位点可以对白血病进行普查呢? 这个问题还有待于进一步的研究。
３.3 在判断预后中的应用
研究还发现[31]， 一些基因的甲基化与预后有关。在一组65例急性早幼粒白血病的研究中， 31例存在p15甲基化的患者5年无病生存率仅为29.64%，显著低于34例无甲基化的患者（79%）。提示p15基因甲基化与预后不良有关。ｐ57 和p73 在多数成人ALL患者存在甲基化， p57和p73的失活在Ph阴性ALL患者提示预后不良[32]。对于新诊断的病例， 检测这些基因的甲基化情况对于明确诊断和判断预后将很有帮助。
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