巫翠萍 覃西 钱士匀
摘 要 目的：观察脑梗塞患者治疗前后血小板活化标志物变化情况并探讨其临床意义。方法：采用流式细胞仪FCM检测59例脑梗塞患者治疗前后血小板活化标志物PAC-I及CD 62P。结果：脑梗塞患者治疗前PAC-I（38.6±12.5）％、CD62P（59.8±9.4）％，明显高于正常对照组（P<0.01）；治疗后，PAC-I（20.4±6.9）％、CD62P（32.4±7.5）％，较治疗前有明显下降（P<0.01），但仍高于正常对照组（P<0.01）。结论：脑梗塞患者体内血小板处于活化状态；流式细胞仪技术为灵敏、特异地检测血小板活化提供了可靠、准确的手段。
关键词：血小板活化；脑梗塞；流式细胞仪
Detection and Clinical Significance of Activated Platelets Marker With Flow Cytometer in Patients with Cerebral Infarction
巫翠萍 覃西 钱士匀
海南医学院附属医院检验科，海口 570102
WU Cui-ping，QIN Xi，QIAN Shi-yun.
Department of clinical laboratory，The affiliated hospital of Hainan Medical College，Haikou，Hainan Province 570102
ABSTRACT
Objective：To investigate the changes of activated platelets and their clinical significance in patients with cerebral infarction before and after treatment.
Methods：The activated platelets PAC-I and CD62P from 59 patients with cerebral infarction were studied by flow cytometry before and after treatment.
Results：PAC-I[（38.6±12.5）％] and CD62P[（69.8±9.4）％] in patients with cerebral infarction were higher than those in the normal (P<0.01)before treatment，whereas PAC-I[（20.4±6.9）％] and CD62P[（32.4±7.5）％] were lower than those before treatment(P<0.01)，but they were higher than those in the normal(P<0.01).
Conclusions：The platelet of cerebral infarction patients are in active state；Flow cytometry can provide a reliable and exact method for detecting activated platelets sensitively.
Keywords：Platelet Cerebral Infarction Flow Cytometry
很多临床研究证明，脑梗塞患者体内血小板处于活化状态，抗血小板治疗可以降低脑梗塞的发病率[1]。检测血小板活化的方法很多，如利用放免的方法或ELISA测定血浆中?-TG、PF4和血小板膜表面的a- 颗粒膜蛋白GMP-140分子数，但都存在一定的缺陷。流式细胞仪技术FCM和血小板糖蛋白单克隆抗体McAb为灵敏、特异地检测血小板活化标志物提供了可靠、准确的手段。本文利用FCM检测了59例脑梗塞患者治疗前后血小板活化标志物PAC-I及CD62P，并与正常对照组比较，以探讨血小板活化在脑梗塞发生、发展、治疗及预后中的临床意义。
一、材料与方法
１.研究对象：
(1)脑梗塞患者组 59例，男36例，女23例，年龄47-82岁，平均年龄64.5岁。均符合1995年全国第四届脑血管病会议制订的诊断标准[2]
(2)正常对照组 20例，男12例，女8例，年龄42-71岁，平均年龄56.5岁。皆系门诊正常体检者，均排除心脑血管性疾病、高血压、糖尿病史。
2.方法
(1)试剂：单克隆抗体 PAC-I FITC为异硫氰酸荧光素标记的抗血小板活化GPI1b/Ⅲa即纤维蛋白原受体（Fib-R）的McAb、CD62P PE为藻红蛋白标记的抗P-选择素的McAb、CD61 per-cp为Peridinin chlorophyll protein标记的血小板糖蛋白Ⅲ的McAb。阴性对照 RGDS为PAC-1阻断剂、Mouseγ1PE为藻红蛋白标记的鼠IgG。所有试剂均购自美国BD公司。
(2)仪器设备：美国BD公司生产的FACSCaLibur流式细胞仪。
(3)样本处理：采用大号针头静脉采血3ml，弃去混有组织液的前2ml，剩余的1ml加入CTAD抗凝管，轻轻混匀。
(4)荧光抗体染色：于10分钟内在试验管中加入PAC-I FITC、CD62P PE、CD61 per-cp各20μl，在对照管中加入PAC-I FITC、IgG1PE、CD61 per-cp各20μl及RGDS10μl，各管分别加入混匀的全血5μl。室温下避光孵育20分钟，加入2-8?CPBS，充分混匀，阴暗处放置30分钟。
(5)FCM检测：打开CellQuest，调出以CD61 per-cp为阳性的获取条件，FSC和SSC均选择Log方式，使用对照管调整FL1和FL2的PMT，使阴性群体位于FL1vs FL2点图的左下角，获取各管的实验数据。
(6)统计学分析，实验数据以X±S表示，资料比较采用t检验。
二、结果
1.在CD61vsSSC点图中找出CD61Per-CP阳性的血小板群（单个血小板和粘附在WBC上的血小板），设门，门内作PAC-I FITCvsCD61P PE点图的双参数分析。血小板活化后PAC-I与CD62阳性表达见图1、图2。
2.脑梗塞患者治疗前血小板活化标志物PAC-I和CD62P阳性表达率明显增高，与正常对照组比较，差异显著（p<0.01），其中37例经1-2个疗程的系统治疗，临床症状明显缓解后再次抽血检测，结果较治疗前有明显下降（p<0.01），但仍高于正常对照组（p<0.01），见表1。
三、讨论
大量的研究资料表明[3]血小板活化在脑梗塞的动脉粥样硬化性血栓形成中起着关键性的作用，CD62在早期就参与了动脉粥样硬化的形成，且血小板膜糖蛋白与动脉硬化呈正相关。由于动脉硬化，血管损伤,胶原暴露，促使血小板活化，血小板粘附、聚集和进一步释放血管活性物质，群聚红细胞，粘度和血液凝固性增高，血流缓慢，最终形成血小板-纤维蛋白血栓，堵塞血管，造成梗死。而组织缺血后的再灌注损害产生大量自由基，其它内皮细胞和血小板刺激物质，释放的凝血酶促使内皮细胞和血小板表达GMP-140，后者又进一步导致白细胞粘附和粘附的细胞变化，组织因子释放，凝血系统激活，反过来加剧血小板活化，形成恶性循环。[4]
本实验选择了PAC-I和CD62P这两种可以反映血小板早期活化和晚期活化的分子作为观察血小板活化的分子标志物。PAC-I即活化的GPI1b/Ⅲa复合物，主要是纤维蛋白原受体，其主要功能是与纤维蛋白原Fg结合，通过Fg的桥梁作用把血小板与血小板之间、血小板与血管内皮下成分连接起来形成血小板血栓。未活化血小板即存在GPI1b/Ⅲa，但藏于血小板膜内侧，不能与 Fg结合。血小板活化时，藏于血小板膜内侧GPI1b/Ⅲa首先暴露于血小板表面，成为血小板活化的早期标志物。CD62P即GM-140，静寂时选择性地分布在血小板胞浆内的α-颗粒上，血小板活化时，α颗粒迅速与血小板膜融合并向膜外释放，使血小板表面高度表达CD62P。因此，CD62P已成为目前最具特异性血小板活化标志物[5]。
本文结果显示，脑梗塞患者血小板活化标志物PAC-I及CD62P阳性表达率均显著增高，与正常对照组比较有显著意义（P<0.01）,表明脑梗塞患者体内血小板高度激活，血小板活化是脑梗塞形成的主要原因。动态观察发现，脑梗塞经系统治疗，临床症状明显缓解后， PAC-I及CD62P阳性表达率较治疗前均显著下降（P<0.01），两者的共同消长进一步说明血小板活化与脑梗塞密切相关。
值得特别提出的是，脑梗塞治疗后PAC-I及CD62P较治疗前显著下降，但两者的阳性表达率仍高于正常对照组。提示由于动脉硬化的不可逆转，由此而引起的血小板活化是一个不易消除的问题，对于恢复期的病人应长期抗血小板活化治疗，以防止血栓的形成。同时我们还观察到4例病人经溶栓治疗后，PAC-I及CD62P阳性表达率仍居高不下（PAC-I>40％、CD62P>75％），2例分别在5个月和8个月后再次发生脑梗塞，1例7个月后心肌梗死，1例3个月发生脑出血。血小板持续活化是否为溶栓失败和血管再闭塞的原因，有待于进一步探讨。
过去判断体内血小板活化程度往往采用ELISA或放射免疫法测定血小板的释放产物如?-TG、PF4及血小板花生四烯酸的代谢产物如TXA4、PGI2的含量变化或测定胞浆、血小板膜上的GMP-140数，但其标本制备比较困难，易受体内外多种因素影响，特异性低，不能准确地反映体内血小板的活化程度，应用流式细胞仪技术FCM和经荧光标记的单克隆抗体McAb测定血小板膜糖蛋白克服了以前测定方法上的缺陷，简便、快速、灵敏、特异，是测定血小板活化的有效方法，值得推广。
参考文献
1. Swiderek W，Kozubski C. Abnormalities in platelet me mbrane atructure and function in Alzheimer, s disease and ische mic stroke. Platlet，1997，8：125-133.
2. 中华医学会神经病学分会。脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准（1995）。中华神经科杂志，1996，29(6)：381-383.
3. Corash L. Measure ment of platelet activation by fluorescence－activated flow cytometry[J].Blood Cells，1990，16：27.
4. Frijns CJM，Kappelle LJ，van Gijn j，etal. Soluble adhesion molecules reflect erdothelial cell activation in ische mic stroke and in carotid atherosclerosis [j].Stroke，1997，28：2214-2218.
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5. 王建中，孙柿，王淑娟，等。流式细胞仪检测活化血小板。中华医学检验杂志，1994，17：232.
