骆群，张献清，刘景汉 第四军医大学学报 2005 年 7 月 第 25 卷 第 14 期
Immunosuppressive effect of free hemoglobin on lymphocyte transformation function
LUO Qun, ZHANG XianQing, LIU JingHan
1Department of Blood Transfusion, PLA General Hospital ,Beijing 100853, 2Department of Blood Transfusion , Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China
【Abstract】 AIM: To study the immunosuppressive effect of free hemoglobin on lymphocyte transformation function. METHODS: Using twoway mixed lymphocyte reaction (MLR), cell culture and incorporation of 3Hthymidine (3HTdR), we added free hemoglobin (FHb) at different concentrations to the reaction system and raised the concentration of antigen presentation cells (APC) with normal APC concentration MLR as negative control and cyclosporinA (CsA) as positive control. The ratio of the above factors in suppressing MLR was calculated. RESULTS: The suppressive effect of FHb increased with its concentration. When the concentration of APC in the system was twice that of the normal, the suppressive effect of free hemoglobin became weaker. CONCLUSION: Free hemoglobin may suppress MLR by disturbing the APC function. We can use this method to study the immunomodulation of large volume blood transfusion.
【Keywords】 lymphocyte culture test, mixed; hemoglobins; antigenpresenting cells
【摘要】 目的： 研究游离血红蛋白（FHb）对淋巴细胞转化的抑制作用. 方法： 利用双向混合淋巴细胞反应（MLR）技术、细胞培养技术、及3H胸腺嘧啶（3HTdR）掺入法，将FHb按不同浓度比例加入MLR体系，及增加抗原提呈细胞（APC）浓度，以正常APC外周血单个核细胞（PBMC）的MLR为阴性对照，以环胞菌素A为阳性对照，计算上述因素对MLR的抑制率. 结果： 随着FHb浓度的增加，其抑制MLR的作用增强（P<0.01）. 两倍APC情况下可以明显减弱FHb对MLR的抑制作用（P<0.05）. 结论： FHb可通过干扰APC的提呈功能而抑制MLR，可以应用此方法来解释及证实大剂量输血致受者外周血的FHb增加从而对机体产生的免疫调节作用.
【关键词】 淋巴细胞培养试验，混合；血红蛋白类；抗原呈递细胞
0引言
输血可延长患者移植肾的存活期［1］，也可增加肿瘤患者术后肿瘤复发及外科手术患者的术后感染率［2，3］. 输注红细胞制品尤其是库存时间较长者在受血后游离血红细胞蛋白含量增高［4］，游离血红蛋白是否会对机体的免疫状态产生影响尚无报道. 我们利用在混合淋巴细胞反应体系中加入游离血红蛋白，并改变APC细胞的数量 ，研究其对淋巴细胞的转化增殖的影响.
1材料和方法
1．1材料
人淋巴细胞分离液，密度为1.077±0.002（Amersham Biosciences公司）；96孔培养板（Cellstar公司）；RPMI 1640培养基（Gibco公司）；健康献血者外周血12人份(6对)，每份20 mL；10 g/L游离血红蛋白，利用低渗或加热煮沸方法获得；人AB血清，选择多人份AB血型全血，经按正常血清制备方法获得；3HTdR（北京原子能研究院）；环孢菌素A（CsA， 瑞士Novartis医药公司）；5417R型高速台式冷冻离心机，德国Eppendorf公司生产 ；3111型CO2培养箱，Forma公司生产；1450型液闪仪，美国MICROBETA公司生产.
1．2方法
按文献［5］方法进行，取6对O型经枸椽酸钠枸椽酸葡萄糖（ACD）抗凝外周血20 mL，分别用无菌生理盐水等体积稀释. 先向试管中加入人淋巴细胞分离液，再沿试管壁轻轻滴加稀释后的人外周血，二者比例约为1∶2（V/V），以2000 r/min离心20 min，吸取中间的白膜层，即外周血单个核细胞（PBMC）层，放于无菌生理盐水中洗涤，以2000 r/min离心10 min，弃上清，将沉淀打匀，用无菌生理盐水洗涤. 再次以1500 r/min离心10 min，弃上清，将沉淀重悬于含100 mL/L人AB型血清的RPMI 1640培养基中，留取部分密度为1×109/L的PBMC样本，而大部分制成浓度为2×109/L的PBMC细胞加入RPMI1640培养基中，置50 mL/L CO2，37℃细胞培养箱培养1 h. 取上层细胞制成去APC的浓度为1×109/L的PBMC，加入含100 mL/L AB血清的RPMI1640培养基中，用培养基将下层贴壁细胞轻轻吹打下来，制成含2倍APC的密度为1×109/L的PBMC，置于100 mL/L AB型血清的RPMI1640培养基中. 将两人份PBMC混合后接种于96孔U型培养板，每孔加入100 μL，FHb组分别使每孔浓度达到2，4，8 g/L. 阳性对照孔加入CsA，终浓度为100 nmol/L. 置50 mL/L CO2，37℃细胞培养箱培养6 d. 培养结束后，掺入3HTdR，37 kBq/孔，继续培养12~16 h，将细胞收集到纤维素膜上，晾干后加闪烁液，测定γ射线强度（cpm）. 加样孔的排列如下 (每组3个复孔)∶以正常APC的一对PBMC的MLR为阴性对照组，CsA组为阳性对照（正常APC），实验组为血红蛋白组，浓度分别为1， 2， 4， 8 g/L，同样分组方法将APC增加到2倍，另将去除APC的两人份PBMC加入同一孔反应，同时培养并检测. 抑制率：（1-cpm实验/cpm未抑制）×100%.
统计学处理： 采用SPSS8.0软件分析，组内采用方差分析，各FHb组组间进行成对t检验.
2结果
2．1APC对双向混合淋巴细胞反应的影响APC组和2倍APC组CsA阳性对照抑制率（%）分别为98.6±9.4和98.2±10.2，对照组正常APC组cpm值 为10430，2倍APC组cpm值为16609，反应良好，增加APC数量，双向淋巴细胞反应性增强；未加APC组cpm值为1009，说明在无APC存在的情况下，双方淋巴细胞彼此无反应性.
2．2FHb对双向混合淋巴细胞反应的影响正常APC与2倍APC两大组中， 组内差异有显著性意义，FHb 浓度为4 g/L组与1 g/L组的抑制率相比有显著性差异（P<0.05），8 g/L组与1 g/L组的抑制率相比有十分显著的差异（P<0.01）. 组间FHb浓度为8 g/L时2倍APC组当与正常APC组比较有显著差异（P<0.05）. 说明随FHb浓度的增加，其对混合淋巴细胞反应的抑制作用增强（Tab 1）.表1游离血红蛋白对双向混合淋巴细胞反应的抑制率（略）
3讨论
在双向混合淋巴细胞反应体系中，从外周血分离的单个核细胞中含有3%~5%的单核细胞，具有抗原提呈功能，称为APC，递呈与自身MHCII类分子结合的异体抗原完成双识别，刺激CD4+细胞，诱导其增殖并分泌IL2等细胞因子，通过自身反馈作用不断增殖, 诱导CD8+细胞活化并发生增殖，由于T细胞的增殖时可以利用3H标记的胸腺嘧啶，从而可以了解T细胞转化功能及免疫状态. 无APC的混合淋巴细胞反应很弱，说明在没有APC的提呈抗原时，T淋巴细胞无增殖；而两倍APC的淋巴细胞增殖反应的cpm值是正常APC的1.6倍. 加入FHb后，由于其可被APC吞噬清除，消弱提呈对方淋巴细胞不同于己方某种抗原的能力，因此此体系中加入FHb势必减弱APC的正常提呈功能，随着FHb浓度的加大，APC提呈功能被抑制，淋巴细胞转化率下降达50%. 此时如将APC细胞数加到两倍，FHb对混合淋巴细胞反应的抑制率下降，说明两倍APC可以明显减弱FHb对混合淋巴细胞反应的抑制作用，FHb确实干扰了APC的提呈功能而影响淋巴细胞的反应性. 从临床输血的实践看，库存血上清液的FHb质控标准为不超过血液总血红蛋白的1%，约<2 g/L. 无论自体或异体血液，由于外周血红细胞含有各胞龄的红细胞，随着保存期的延长其中衰老红细胞会破裂溶血，从而超过机体利用结合珠蛋白清除FHb的能力［4］，血浆中势必存在过剩的FHb. 我们的实验研究表明，FHb会明显影响APC的提呈功能，抑制淋巴细胞的转化功能，从而导致CD8+细胞的杀伤功能受到明显的抑制，机体特异性的抗肿瘤能力及抗感染能力下降. 而新鲜血由于保存期短对受者的免疫抑制作用较小.
【参考文献】
［1］ JovicicPavlovic S, Lezaic V, Simic S, et al. Effect of donorspecific blood transfusion on the outcome of kidney transplantation［J］. Srp Arh Celok Lek, 2003;131(1112):449-453.
［2］ Rui JA, Zhou L, Liu FD, et al. Major hepatectomy without blood transfusion: Report of 51 cases ［J］ .Chin Med J (Engl), 2004;117(5):673-676.
［3］ Vamvakas EC, Blajchman MA. Prestorage versus poststorage white cell reduction for the prevention of the deleterious immunomodulatory effects of allogeneic blood transfusion ［J］ . Transfus Med Rev, 2000;14(1):23-33.
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［5］ 沈关心，周汝麟. 现代免疫学实验技术［M］. 第2版，武汉： 湖北科学技术出版社，2002:398-400.
作者简介：骆群（1967），男（汉族），安徽省合肥市人. 博士生（导师刘景汉）. Tel. (010)66939434Email.luoqun@public.bta.net.cn
（1解放军总医院输血科，北京 100853， 2第四军医大学西京医院输血科，陕西 西安 710033）
