师长宏，王晓武，朱德生，李元，徐志凯    第四军医大学学报 2005 年 10 月 第 25 卷 第 20 期

    Fusion expression and purification of Mycobacterium tuberculosis difference protein MPT64 and ESAT6
 
　　SHI ChangHong, WANG XiaoWu, ZHU DeSheng, LI Yuan, XU ZhiKai

　　1Lab Animal Center, 2Department of Radiation Medicine, School of Preventive Medicine   3Department of  Microbiology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China

　　【Abstract】 AIM: To clone and fusion express secreted protein MPT64 and ESAT6 of Mycobacterium tuberculosis (MTB). METHODS:  The gene encoding MPT64 and ESAT6 mature protein was amplified by polymerase chain reaction（PCR）from genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain, inserted into cloning vector pGEMTeasy for sequence analysis and then digested by restriction endonuclease and cloned into expression vector pProEX HT. The recombinant plasmid was transformed into expressive strain E.coli DH5α and then induced with IPTG. The fusion protein was purified by NiNTA purification system. RESULTS:  The sequences of mpt64 and esat6 amplified by PCR were identical with those reported in GenBank. The recombinant plasmid expressed fusion protein of MTB MPT64ESAT6 had the relative molecular mass（Mr）of 38×103, which was confirmed by Western blot analysis with speciesspecific monoclonal antibody against 6×His mAb. The fusion expressed protein was insoluble and could be purified by NiNTA purification system. CONCLUSION:  Secreted protein MPT64ESAT6 of Mycobacterium tuberculosis is successfully fusion expressed in E.coli DH5α,  which can be used for TB diagnosis.

　　【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis; MPT64; ESAT6; gene expression

　　【摘要】 目的： 融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64ESAT6，为结核病的预防提供可供选择的有效亚单位疫苗. 方法： 设计含不同酶切位点的mpt64和esat6引物，采用PCR的方法从结核分枝杆菌毒株H37RvDNA中分别扩增出相应大小的DNA片段，将片段分别与Teasy载体连接测序. 将测序正确的mpt64和esat6按照不同的酶切位点克隆入pProEX HT表达载体，挑选出阳性克隆，将诱导的表达产物进行SDSPAGE蛋白电泳分析，同时与6×His的mAb进行Westernblot分析，并用NiNTA亲合柱纯化表达产物. 结果： PCR获得的mpt64和esat6序列与GenBank报道的完全一致. 两者在大肠杆菌DH5α株中融合表达的产物Mr为38×103，与预计大小相吻合. Westernblot结果显示，在Mr约38×103处有表达产物与6×His mAb特异性结合带. 表达产物为包涵体，通过NiNTA纯化系统，可得到纯化的目的蛋白. 结论： 结核分枝杆菌的分泌蛋白MPT64和ESAT6被成功的融合表达，有望为结核的临床判定提供有效的诊断试剂.

　　【关键词】 分枝杆菌，结核；MPT64；ESAT6；基因表达

　　0引言

　　目前对结核病（TB）的诊断方法主要依赖结核菌素试验结合抗酸染色镜检，该方法准确率较高，但漏检率亦高，其主要原因是人群普遍接种卡介苗（bacillus calmette guerin, BCG）后，很难区分结核分枝杆菌（MTB）的感染和BCG的接种［1］. MPT 64（结核分枝杆菌64蛋白）和ESAT6（Mr6000的早期分泌蛋白）只存在于MTB毒株中而BCG中缺失［2］，研究发现重组的MPT64和ESAT6蛋白可使TB患者IFNγ释放量明显高于BCG免疫者，在TB感染动物体内还可引发迟发型超敏反应（delayedtype hypersensitivity, DTH），而BCG接种者无反应［3］，因此该蛋白可用作诊断试剂. 本研究表达纯化了MPT64和ESAT6的融合蛋白，以期替代结核菌素试验，简便准确的区分TB患者与BCG免疫的正常人群.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　E.coli DH5α由第四军医大学实验动物中心保存；MTB H37Rv株由陕西省结核病防治研究所王瑞副主任技师惠赠；克隆质粒pGEMTeasy和pGEM7Zf，表达质粒载体pProEX HT质粒，购自Promega公司；Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, DNA Markers均购自Takara；异丙基硫化βD半乳糖苷（IPTG）购自Pharmacia公司；羊抗鼠IgGHRP购自华美生物公司.

　　1.2方法

　　1.2.1目的基因的扩增按文献［4］的方法获得的结核菌毒株H37Rv的DNA，以此为模板，设计4对引物，mpt64 PCR引物P1： 5′GCGGATCCGTGCGCATCAAGATCTTC3′，含BamHⅠ酶切位点；P2: 5′CGAAGCTTCTAGGCCAGCATC3′，含HindⅢ酶切位点；esat6 PCR引物P1: 5′GAAGCTTACAGAGCAGCAGTG3′，含HindⅢ酶切位点；P2: 5′GGAATTCATCGATCTATGCGAACATCCCAGTGACG3′,含EcoRⅠ酶切位点和终止码；扩增全长为687 bp的mpt64基因和288 bp的esat6基因. PCR反应条件： 94℃ 45 s, 60℃ 45 s, 72℃ 50 s，共30个循环，再于72℃延伸2 min.
 
　　1.2.2目的基因的测序与克隆用T4连接酶将两种PCR产物分别与pGEMTeasy连接，转化E.coli DH5α，将提取的质粒DNA用双酶切鉴定，观察有无目的片段. 将筛选出的阳性克隆采用双向测序（由北京赛百盛公司完成测序），分别计作MPT64Teasy；ESAT6Teasy.

　　1.2.3含目的基因表达载体的构建用BamHⅠ和HindⅢ双酶切MPT64Teasy获得的片段，与用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切ESAT6Teasy获得的片段联合克隆入pGEM7Zf载体中获得克隆载体MPT64ESAT6pGEM7Zf，用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切MPT64ESAT6pGEM7Zf获得目的片段MPT64ESAT6，将此片段克隆入pProEX HT中获得表达载体MPT64pProEX HTESAT6.

　　1.2.4融合基因的诱导表达将质粒MPT64pProEX HTESAT6转化E.Coli DH5α，挑选4个阳性克隆分别接种于5 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养18 h，分别取50 μL加入5 mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振荡培养2~3 h, 0.5 mol/L  IPTG诱导4 h，进行150 g/L SDSPAGE，并通过凝胶薄层扫描测定其表达量.
 
　　1.2.5目的基因的鉴定将上述表达产物进行150 g/L SDSPAGE后转移至硝酸纤维素膜上，用50 g/L脱脂奶封闭过夜，加6×His mAb作用1 h，以10 mmol/L PBS（pH 7.2）洗涤后，加HRP标记的羊抗鼠IgG作用1 h，以二氨基联苯胺显色观察结果.
 
　　1.2.6检测表达产物的可溶性在上述表达样品悬液中加入1 μL溶菌酶(10 g/L)，颠倒混匀，室温下孵育15 min，液氮20 s/温水1 min反复冻融10次，12 000 g离心10 min，取上清同上处理后进行SDSPAGE，观察表达产物的可溶性.
 
　　1.2.7亲和色谱法纯化目的蛋白采用Invitrogen的NiNTA纯化试剂盒纯化目的蛋白. 将50 mL的诱导菌液离心，制备上柱样品，按照包涵体（Denaturing condition）条件进行亲和色谱纯化，收集洗脱液，-20℃保存.

　　2结果

　　2.1目的基因的扩增克隆及测序鉴定用PCR法从结核菌毒株H37Rv的DNA中扩增MPT64和ESAT6 DNA片段，此片段被顺利克隆入pGEMTeasy载体，双酶切和测序证实所克隆的基因完全正确（Fig 1）.

　　2.2含目的基因表达载体的构建MPT64pProEX HTESAT6被BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切可得到约975 bp的片段与mpt64和esat6大小之和相一致.

　　2.3目的基因融合表达产物的SDSPAGE分析结果发现在Mr约为38×103处有一条表达带，由于mpt64与esat6大小之和为975 bp（687+288），融合蛋白理论大小Mr为35×103，加上表达载体中6×His(histidine，组氨酸)的大小约为3×103，所以整个融合蛋白的Mr大小约为38×103（Fig 2）.

　　2.4检测表达产物的可溶性分析经凝胶薄层扫描，测得重组菌表达带的蛋白量约占菌体总蛋白量的17%，且表达的融合蛋白大多以包涵体状态存在.

　　2.5表达产物的Westernblot鉴定表达载体pProEX HT含有6个组氨酸，因此MPT64ESAT6应与组氨酸融合表达(Fig 3)，蛋白免疫印记分析，在相对Mr约为38×103处表达有一条显色带，表明诱导表达产物可能含有与抗6×His的特异性mAb相结合的表位，此处为MPT64ESAT6融合表达位点.

　　2.6亲和色谱纯化目的蛋白取变性复性和透析后的MPT64ESAT6融合蛋白的上清，经NiNTA亲和色谱柱连续上样收集洗脱液，进行SDSPAGE分析. 可获得初步纯化的目的蛋白，其纯度约为75%.

　　3讨论

　　分泌蛋白ESAT6和MPT64均可在MTB感染动物体内引发DTH反应，而BCG接种者无反应［5,6］. Nakamura RM等［7］将MPT64蛋白承载在一种皮肤试纸上检测正接受临床治疗的TB患者，不仅可区分活动性TB患者和正常人群，还可检测TB患者的化疗效果，因此该类蛋白可用作诊断试剂. 目前国外已开始将单个的ESAT6或MPT64蛋白用于皮肤实验，检测其表达水平可间接反映MTB感染的程度［8］. 与单个蛋白相比较，我们的研究获得的融合蛋白兼有两种蛋白各自功能，且只需一次皮肤试验便可大大提高TB患者的检出率.

　　编码ESAT6和MPT64的基因分别为687 bp和288 bp，重组质粒MPT64pProEX HTESAT6双酶切后获得的片段约为975 bp，与GenBank中报道的mpt64和esat6大小之和相一致.  SDSPAGE分析目的基因表达产物Mr约为38×103，与两种蛋白理论分子量之和相一致. 我们选择mpt64与esat6融合的表达，具有以下优点： ① 融合蛋白的转录和翻译起始均由同一大肠杆菌调控序列控制，可提高表达产量. ② 使用ESAT6或MPT64单个蛋白进行结核菌素试验，抗原性较弱，可能出现一定比例的漏检，而融合表达的蛋白具有较大的分子量，有利于提高小分子量外源蛋白的免疫原性，在本研究中主要有利于ESAT6的表达. ③ 融合蛋白具有两种蛋白的生物学功能，使用方便，操作简单，更有利于区别TB感染者和BCG接种人群. 本研究通过检测组氨酸的表达，可间接表明mpt64和esat6的融合表达，同时6×His的表达为进一步纯化蛋白提供了亲和位点.

　　【参考文献】

　　［1］ Buddle BM, Wards BJ, Aldwell FE, et al. Influence of sensitization  to  environmental mycobacteria on subsequent vaccination against bovine tuberculosis ［J］. Vaccine, 2002; 20(78):1126-1133.

　　［2］ Kamath AT, Feng CG, Macdonald M, et al. Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of  Mycobacterium tuberculosis ［J］. Infect Immun, 1999;67(4):1702-1707.

　　［3］  Mostowy S,  Behr MA. Comparative genomics in the fight against tuberculosis: Diagnostics, epidemiology, and BCG vaccination ［J］. Am J Pharmacogenomics, 2002;2(3):189-196.

　　［4］ 范雄林，徐志凯，李元，等. 结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白基因免疫［J］. 第四军医大学学报,2001;22(14):1283-1287.

　　Fan XL, Xu ZK, Li Y, et al. Gene vaccination of Mycobacterium tuberculosis DNA vaccine encoding mature form of Ag85B ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2001;22(14):1283-1287.

　　［5］ Brandt L, Elhay M, Rosenkrands I, et al. ESAT6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis ［J］. Infect Immun,2000;68(2):791-795.

　　［6］ Abe C, Hirano K, Tomiyama T, et al. Simple and rapid identification of the Mycobacterium tuberculosis complex by immunochromatographic assay using antiMPT64 monoclonal antibodies  ［J］. J Clin Microbiol, 1999; 37(11): 3693-3697.

　　［7］ Nakamura RM, Einck L, Velmonte MA, et al. Detection of active tuberculosis by an MPT64 transdermal patch: A field study ［J］. Scand J Infect Dis, 2001;33(6):405-407.

　　［8］ Wang QM, Sun SH, Hu ZL, et al. Improved immunogenicity of a tuberculosis DNA vaccine encoding ESAT6 by DNA priming and protein boosting ［J］. Vaccine, 2004;9:(22)3622-3627.

　　基金项目：国家自然科学基金（30400381）

　　通讯作者：师长宏(1973)，男(汉族)，陕西省眉县人. 博士，讲师. Tel. (029)83374787Email.changhong@fmmu.edu.cn

　　（第四军医大学： 1实验动物中心， 2预防医学系放射医学教研室， 3基础部微生物学教研室，陕西 西安710033）

 

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