何谦，楚雍烈，林联成，王香玲，刘余静 第四军医大学学报 2005 年 10 月 第 25 卷 第 20 期
Preparation and evaluation of proteinchip for different HCV antibody detection
HE Qian, CHU YongLie, LIN LianCheng, WANG XiangLing, LIU YiuJing
1Department of Clinical Laboratories, Second Hospital of Xian Jiaotong University, Xian 710004, China, 2Department of Pathogenic Biology, School of Medicine, Xian Jiaotong University, Xian 710054, China, 3Shenzhen Saier Biological Company, Shenzhen 518000, China
【Abstract】 AIM: To prepare and evaluate the clinical application of proteinchip for different hepatitis virus C (HCV) antibodies. METHODS: Proteinchip for different HCV antibodies was established by coating chimeric antigen and the 4 segments of HCV antigens on the slide. The results of this method were compared with those of RIBA and ELISA. RESULTS: The negative result and the positive result of proteinchips of chimeric antigen accorded with ELISA were 93.8 % and 97.1%, respectively. When it came to RIBA, the accordance rate was 96.9 % and 98.5%, respectively. The accordance rates of negative and positive results of proteinchip of the 4 segments of HCV antigens with ELISA were 96.8% and 97.1%, respectively, while they turned out to be 100% and 98.5% with RIBA. CONCLUSION: The proteinchip for different HCV antibodies has a high accordance rate with RIBA（P<0.05）. Proteinchip for different HCV antibodies has high accuracy and can decrease the false positive rate.
【Keywords】 hepacivirus; protein array analysis; antibodies
【摘要】 目的： 制备丙型肝炎病毒（hepatitis virus C, HCV）不同片段抗体蛋白芯片，并对其临床应用价值进行评价. 方法： 分别取HCV融合抗原及分片段抗原，点至醛基化玻片上，制成HCV不同片段抗体蛋白芯片. 进行抗HCV（ELISA）试剂和RIBA试剂与蛋白芯片法的比较. 结果： 蛋白芯片的融合抗原检测与ELISA法相比，阴性符合率为93.8 %，阳性符合率为97.1% . 蛋白质芯片分片段检测与ELISA法相比，阴性符合率为96.8 %，阳性符合率为97.1%. 蛋白芯片的融合抗原检测与RIBA法相比，阴性符合率为96.9% , 阳性符合率为98.5 %. 蛋白芯片分片段检测与RIBA法相比，阴性符合率为100%, 阳性符合率为98.5%. 结论： 蛋白芯片法与RIBA试剂检测结果相比较，与RIBA试剂有良好的一致性（P<0.05）)，证明其具有良好的检测准确率,并可以降低ELISA法的假阳性.
【关键词】 肝炎病毒；蛋白质陈列分析；抗体
0引言
近年来，丙型肝炎病毒（HCV）不同编码区抗体检测成为一个热点［1，2］. 虽然目前国外都用RIBA3.0试剂作为HCV的确认试剂，但是其有价格昂贵、操作复杂等诸多不足. 丙肝患者的确诊、献血员筛选、治疗药物的研发、患者的追踪观察迫切需要更先进、更简便、更廉价的诊断试剂的问世，为此我们进行了HCV不同片段抗体蛋白芯片的实验研究, 获得了较满意的结果.
1材料和方法
1.1材料
美国Cartesian点样仪；美国ScanArray4000B 扫描仪；基因工程表达的HCV融合抗原、核心抗原（C区）、NS4抗原、NS5抗原（中国医学科学院病毒所）；基因工程表达的NS3抗原C7（日本东燃公司）；CY3抗人IgG 结合物（美国Sigma 公司）；不同片段抗体标准品由深圳赛尔生物技术有限公司惠赠；RIBA3.0试剂，载玻片（美国Chiron公司）；抗HCV（ELISA）试剂（上海永华细胞和基因高技术分析中心）；血清标本99例，均来源于西安交通大学第一医院和第二医院门诊及住院患者.
1.2方法
1.2.1包被和封闭将融合抗原及各片段抗原配成不同浓度，用点样仪将其点样于醛基化玻片上，37℃温浴2 h后晾干. 用含100 mL/L 小牛血清的PBS(0.01 mmol/L PBS, pH 7.2) 37℃封闭2 h，晾干放于4℃冰箱过夜后备用.
1.2.2检测取出制备好的芯片，加1∶10倍稀释血清10 μL， 37℃水浴30 min， PBST（0.01 mmol/L PBS, pH 7.2, 0.5 mL/L Tween 20）洗涤5次，然后加CY3抗人Ig G 结合物10 μL ， 37℃水浴30 min，PBST洗涤5次后，用ScanArray4000B扫描仪扫描.
1.2.3结果判断不同片段中有一个阳性判为可疑，两个或以上片段阳性则判为阳性标本.
统计学处理： 方法准确性判断采用Youden指数，方法一致性判断采用Kappa值.
2结果
2.1实验条件选择用棋盘滴定法进行抗原浓度、样品稀释倍数及CY3抗人Ig G 结合物浓度的确定. 不同浓度的各片段抗原点样，测试标准品并与RIBA试剂比较，符合率最高者为点样浓度. 结果以融合抗原100 μg/L, C区抗原100 μg/L, NS4抗原50 μg/L, NS5抗原50 μg/L为最佳. 样品稀释倍数以1∶10为宜. CY3抗人Ig G 结合物浓度测定以1∶500为最佳浓度.
2.2重复性和稳定性试验将上述包被好的蛋白芯片分别置于4℃冰箱和室温下贮存7 d和1, 3, 6 mo后取出 ，用上述方法分别检测20例阳性标本和正常对照，结果与新鲜包被的蛋白芯片一致.
2.3特异性试验取甲肝抗体阳性、乙肝表面抗体阳性、巨细胞病毒抗体阳性、类风湿因子阳性血清各20份，用本试剂检测，结果均为阴性.
2.4不同丙肝抗原片段Cutoff值（S /n ）的确定检测407例正常人血清，计算每种抗原的平均荧光强度，求得信噪比. 各片段阴性对照的信噪比应小于2.5. Cutoff值等于各片段阴性对照平均值加3倍标准差，片段信噪比大于Cutoff值时该片段抗体为阳性（Tab 1）.表1不同丙肝抗原片段的均值、标准差和Cutoff值（略）
2.5考核评估蛋白芯片各片段检测与RIBA确证试剂进行比较，结果见Tab 2. 表2HCV蛋白芯片与RIBA各区段抗体检出比较（略）
2.6抗HCV（ELISA）试剂和蛋白芯片法的比较抗HCV（ELISA）试剂检测样本99例，其中阳性标本69例, 阴性30例. 30例抗HCV ELISA 试剂检出的阴性样本，蛋白质芯片的融合抗原检测均为阴性，蛋白质芯片的分片段检测均为阴性；69例抗HCV ELISA 试剂检出的阳性样本，蛋白质芯片的融合抗原检测检出阳性67例，阴性2例；蛋白芯片分片段检测根据不同片段中有1个阳性判为可疑，2个或2个以上阳性则判为阳性标本的判定标准，蛋白质芯片的分片段检测检出阳性67例，阴性1例，可疑标本1例. 统计学分析表明，蛋白芯片的融合抗原检测与ELISA法相比，阴性符合率为93.8 %，阳性符合率为97.1%, 具有较好的一致性（Kappa 值=0.953, P<0.05）. 蛋白质芯片分片段检测与ELISA法相比，阴性符合率为96.8 %，阳性符合率为97.1%，具有较好的一致性（Kappa 值=0.954, P<0.05）.
2.7RIBA试剂和蛋白芯片法的比较RIBA试剂检测样本99例，其中阳性标本66例, 阴性31例，可疑标本2例. 蛋白质芯片的融合抗原检测检出阳性67例，阴性32例. 蛋白质芯片的分片段检测检出阳性67例，阴性31例，可疑标本1例. 统计学分析表明，蛋白芯片的融合抗原检测与RIBA法相比，阴性符合率为96.9% , 阳性符合率为98.5 %. 具有较好的一致性（Kappa 值=0.955, P<0.05）. 蛋白芯片分片段检测与RIBA法相比，阴性符合率为100%, 阳性符合率为98.5%，具有较好的一致性（Kappa 值=0.978, P<0.05）.
2.83例不符合样本的RIBA试剂及PCR检测对3例不符合样本的RIBA试剂及PCR检测结果见Tab 3.表3不符合样本3例的检测结果（略）
3讨论
蛋白芯片是近年伴随基因芯片发展起来的一项新技术［3,4］，这项技术是将蛋白质的分析微缩到小型芯片上，利用荧光或酶显色进行检测，并用电脑进行分析. 该技术在对抗原抗体检测、疾病诊断、药物开发等研究方面显示出快速、高效、高通量处理信息的能力.
我们使用醛基化玻片作为载体，进口激光共聚扫描仪进行荧光强度扫描，进行了HCV不同片段抗体蛋白芯片的实验研究, 并用自制的蛋白芯片对99例标本进行检测. 蛋白质芯片分片段检测与ELISA法相比，阴性符合率为93.8 %，阳性符合率为97.1%. 此结果与文献报道基本一致［5］. 3例抗HCV ELISA 试剂检测阳性样本，蛋白芯片分片段检测检出阳性1例，阴性1例，可疑1例；免疫印迹法RIBA检出阳性1例，可疑2例. 说明蛋白质芯片与RIBA试剂结果有良好的一致性，证明其具有良好的检测准确率，并可以降低ELISA法的假阳性. 对99例标本的检测，蛋白质芯片的融合抗原检测检出阳性67例，阴性32例. 蛋白质芯片的分片段检测检出阳性67例，阴性31例，可疑标本1例. 融合抗原与分段抗原检出病例结果基本一致，只有1例融合抗原阴性，而单片段阳性的结果，这说明了分片段检测的必要性. 其原因可能是融合抗原是C, NS3, NS4, NS5编码区混合抗原，由于抗原不同，不同抗原组合时抗原片段浓度不同，以及载玻片吸附抗原有限，可以造成抗原配伍不合适或抗原相互干扰，从而影响抗原决定簇位点的充分暴露，造成漏检. 蛋白质芯片法检出的1例可疑标本，免疫印迹法RIBA检出的2例可疑标本均为单独C区阳性，其抗NS3, NS4, NS5均阴性，而PCR结果均为阳性. 此结果提示C区可能与病毒复制有关. 应进一步扩大例数进行观察.
通过对100份抗HCVELISA阴性的其他肝病血清，20份巨细胞病毒阳性血清，20份类风湿因子阳性血清，218份正常人血清，用本试剂进行检测，结果均为阴性，证明该试剂与其他肝炎病毒抗体无交叉反应，且不受类风湿因子、巨细胞病毒的影响，具有较好的特异性. 对载玻片进行特殊处理后，蛋白质抗原与片基结合稳定，并保持原活性状态，HCV不同片段抗体蛋白芯片的稳定性及重复性获得满意结果，试剂的稳定性可达1 a，较成熟的技术使其具有了较好的开发前景.
【参考文献】
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［3］罗进,李丁,张文红,等. 蛋白芯片标记系统的优化研究［J］. 第四军医大学学报, 2005; 26(4): 311.
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［5］ 张文，周枚芬，陈立炎，等. 丙型肝炎病毒分片段抗体检测蛋白质芯片的制备及临床评价［J］. 生物化学与生物物理进展, 2003; 30(6): 935.
Zhang W, Zhou MF, Chen LY, et al. Preparation and clinical evaluation of proteinchip for different HCV antibody detection ［J］. Prog Biochem Biophys, 2003; 30(6): 935.
基金项目：陕西省科学技术研究发展计划项目 （2003K10G62）
通讯作者：何谦（1971），女（汉族），陕西省西安市人. 博士生（导师楚雍烈），主管技师. Tel. (029)87679588Email. heqian 1995 @163. com
（西安交通大学： 1第二医院检验科，陕西 西安 710004， 2病原生物学教研室， 陕西 西安 710054, 3深圳赛尔生物技术有限公司，广东 深圳 518000）
