邵清，成军，王琳，张健，卢成哲 第四军医大学学报 2005 年 11 月 第 25 卷 第 21 期
Screening of genes differentially expressed in HepG2 cells transfected with HCV NS3TP6 by microarray assay
SHAO Qing, CHENG Jun, WANG Lin, ZHANG Jian, LU ChengZhe
1Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, PLA 302 Hospital, Beijing 100039, 2Department of CT, PLA 206 Hospital, Tonghua, Jilin 134001, China
【Abstract】 AIM: To study the difference in gene expression in human hepatoblastoma cell line HepG2 cells transfected with HCV NS3TP6expressing plasmid and to further elucidate its molecular biological mechanism. METHODS: Sequence specific primers were designed and synthesized and the NS3TP6coding DNA fragment was amplified with polymerase chain reaction (PCR) technique using pBRTM3011 plasmid containing the full length of HCVH cDNA as the template. The expression vector of pcDNA3.1(-)NS3TP6 was constructed by routine molecular biological methods. cDNA microarray technology was employed to detect the mRNA from the HepG2 cells transfected respectively with pcDNA3.1(-)NS3TP6 and pcDNA3.1(-) using lipofectamine. RESULTS: The expression vector was constructed and confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing analysis. The expression of NS3TP6 protein was confirmed by Western blot hybridization with single chain variable region (scFv) antibody. High quality mRNA and cDNA were prepared and successful microarray screening was conducted. The scanning results indicated that among the 1152 genes which were obtained from gene expression profile analysis, 45 were different, of which 7 genes were upregulated and 38 genes were downregulated in NS3TP6expressing HepG2 cells. CONCLUSION: cDNA microarray technology is successfully used to screen the genes differentially expressed in NS3TP6expressing HepG2 cells, which brings some new clues for the study of the molecular mechanism involved in the HCV infection and hepatocellular carcinoma development induced by HCV NS3TP6 protein.
【Keywords】 hepatitis C virus；NS3 protein；cDNA microarray
【摘要】 目的: 为了研究NS3TP6可能的分子生物学功能，我们应用基因芯片技术，检测丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3 (NS3)反式激活基因NS3TP6的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响. 方法：以分子生物学技术构建NS3TP6的真核表达载体pcDNA3.1(-)NS3TP6，以表达质粒pcDNA3.1(-)NS3TP6转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA. 应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析. 结果：HepG2细胞经转染NS3TP6后，有7条基因表达增强，38条基因表达降低. 结论：应用基因表达谱芯片成功筛选了NS3TP6的反式调节基因，为进一步阐明NS3TP6的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.
【关键词】 丙型肝炎病毒；非结构蛋白3；基因芯片
0引言
丙型肝炎病毒（HCV）感染具有很大的危害性［1,2］. HCV非结构蛋白3（NS3）基因编码的NS3蛋白（631 aa）是一种多功能蛋白质，在HCV复制及表达产物多蛋白裂解加工上起重要作用［3］，在HCV致病（癌）过程中也起着重要的作用，研究其作用分子生物学机制有助于理解HCV感染的慢性化和致癌作用机制. 我们克隆了NS3蛋白反式激活作用的新靶基因，即HCV NS3蛋白反式激活基因6（NS3TP6）［4］. 为进一步了解NS3TP6蛋白可能的分子生物学功能，我们应用基因芯片技术，检测HCV NS3反式激活基因NS3TP6的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响.
1材料和方法
1.1材料
HepG2细胞及感受态大肠杆菌JM109为本室保存；pcDNA3.1(-)真核表达载体购自Invitrogen公司；Lipofectamine PLUS转染试剂购自Gibco公司，mRNA提纯试剂盒为Amersham Pharmacia公司产品；PCRSelect cDNA Subtraction试剂盒，50×PCR Enzyme Mix，Advantage PCR Cloning试剂盒购自Clontech公司；High Pure PCR Product Purification试剂盒购自Boehringer Mannheim公司；T7，SP6通用引物及pGEMTeasy载体为Promega公司产品. cDNA的基因芯片由上海联合基因有限公司提供.
1.2方法
构建NS3TP6蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)NS3TP6，用Lipofectamine PLUS转染试剂将2 μg pcDNA3.1(-)NS3TP6及pcDNA3.1(-)空载体分别转染35 mm平皿HepG2细胞，48 h后收获细胞. 使用mRNA Purification试剂盒，直接提取转染了NS3TP6表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA，经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计进行定性、定量分析. 参照Schena等的方法逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3dUTP标记对照组细胞mRNA（5 μg），Cy5dUTP标记实验组细胞mRNA（5 μg）. 乙醇沉淀后，溶解于20 μL的含0.2 g/L SDS和5×SSC的杂交液中. 包含的1152个cDNA的基因芯片，包括原癌基因和抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增，PCR产物长度为1000～3000 bp. 靶基因以0.5 g/L溶解于3×SSC溶液中，用Cartesian公司的Cartesian 7500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合（2 h）、室温干燥（0.5 h），紫外线（UV）交联，再分别用0.2 g/L SDS、水及0.2 g/L的硼氢化钠溶液处理10 min，晾干备用. 将基因芯片和杂交探针在95℃水浴变性5 min，将混合探针加在基因芯片上，置于60℃杂交15～17 h. 依次以2×SSC+0.2 g/L SDS, 0.1×SSC+0.2 g/L SDS, 0.1×SSC洗涤10 min，室温晾干. 用General Scanning公司的ScanArray 3000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因（24条管家基因，每个基因点2个点，共48个点）对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene3.0软件分析Cy3, Cy5两种荧光信号的强度，计算Cy5/Cy3比值. 阳性结果判断：Cy5/Cy3＞2.0，红色荧光，显示表达增强；Cy5/Cy3＜0.5，为绿色荧光，显示表达减弱.
2结果
总RNA的吸光度A260 nm／A280 nm>1.89，热稳定实验70℃保温1 h与-20℃ 1 h电泳条带比较，显示28 S条带无明显降解，电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA. mRNA主要集中于0.9～4.0 kb的连续条带. 在基因芯片的扫描分析中，如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在2.000以上，就判断为HCV NS3TP6蛋白的上调基因. 共发现有7种基因的表达水平上调，其中包括1种未知功能基因（Tab 1）. 在基因芯片的扫描分析中，如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在0.500以下，就判断为HCV NS3TP6蛋白的下调基因. 在本研究中发现有38种基因的表达水平下调，其中包括3种未知功能基因（Tab 2）.表1NS3TP6上调基因类型（略）表2NS3TP6下调基因类型（略）
3讨论
我们以HepG2细胞基因组DNA为模板，应用聚合酶链反应技术（PCR）扩增的NS3TP6基因片段，常规分子生物学技术构建NS3TP6的真核表达载体pcDNA3.1(-)NS3TP6，利用脂质体转染技术转染HepG2细胞. 从转染和非转染细胞HepG2种提取总mRNA，逆转录为cDNA，并进行基因芯片技术分析. 结果表明，基质金属蛋白酶1等7种基因的表达水平上调，其中包括1个未知功能基因. 小染色体维持缺陷3等38种基因的表达水平下调，其中包括3个未知功能基因，从Tab 1, 2列出的部分表达变化显著的基因中，可看出这些基因涉及细胞信号传导、细胞周期、细胞凋亡、免疫调节、应激反应和炎症反应、能量代谢等生物过程，说明NS3TP6与免疫调节、细胞增殖、分化、凋亡等密切相关.
【参考文献】
［1］ Song ZQ，Hao F，Min F，et al. Hepatitis C virus infection of human hepatoma cell line 7721 in vitro［J］. World J Gastroenterol, 2001; 7: 685-689.
［2］ Deng ZL，Ma Y，Yuan L，et al. The importance of hepatitis C as a risk factor for hepatocellular carcinoma in Guangxi［J］. World J Gastroenterol, 2000; 6: 75-79.
［3］ Yang JM，Wang RQ，Bu BG，et al. Effect of HCV infection on expression of several cancer associated gene products in HCC［J］. World J Gastroenterol, 1999; 5(1): 25-27.
［4］ 邵清，成军，白雪帆，等. 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因6的克隆化研究［J］. 胃肠病学和肝病学杂志，2003; 12(3): 245-247.
Shao Q，Cheng J，Bai XF，et al. Identification and characterization of gene 6 transactivated by hepatitis C virus nonstructural protein 3 with DNA microarray assay［J］. Chin J Gastroenterol Hepatol, 2003; 12(3): 245-247.
通讯作者：成军. Tel.(010)66933392 Email.cj@genetherapy.com.cn
作者简介：邵清（1966）,男（汉族），北京市人. 主治医师，硕士. Tel.(010)66933757Email.sqlym@163.com
（1解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京100039，2解放军206医院CT室，吉林 通化 134001）
