张义 邹雄 杨晓静 单宁宁 秦绪珍 邹明瑾
目的：探讨外周血淋巴细胞（PBL）HLA－B mRNA及HLA－B抗原表达与胃癌发生、分化的关系。
方法：自行设计、筛选HLA－B特异性引物，应用RT－PCR方法检测了30例胃癌患者外周血淋巴细胞HLA－B mRNA的表达，并与流式细胞术检测HLA－B抗原进行比较。
结果：胃癌患者PBL HLA－B mRNA表达率（23.3％）与正常人（87.5％）相比差异显著（P＜0.01），尤以低分化转移胃癌（16％）下降更为明显；而流式细胞术检测高分化未转移胃癌患者PBL HLA－B抗原表达率（88.20％）与正常对照（98.84％）相比，虽然无显著性差异（P＝0.056），但存在明显下降趋势；低分化伴淋巴结转移胃癌（73.26％）则下降显著（P＜0.05）。
结论：胃癌患者淋巴细胞 HLA－B mRNA及HLA－B抗原表达降低或缺失，且与其分化程度相关。检测PBL HLA－B mRNA较HLA－B抗原能更直接、更本质地反映胃癌发生分化的关系。
主题词：淋巴细胞HLA－B；胃癌；逆转录聚合酶链反应；流式细胞术
近十余年来，免疫学上突破性进展是提出了MHC（Major histocompatibility ）在免疫应答中的重要作用。T细胞受体识别MHC（Major histocompatibility）和肿瘤抗原的复合体，是激活机体抗肿瘤免疫第一步。目前学术界已形成共识：肿瘤细胞表面MHC抗原表达下调和肿瘤的发生、分化、转移有关，是导致肿瘤细胞免疫逃逸的重要原因。但有关外周血淋巴细胞HLA（Human leukocyte antigen）表达与肿瘤发生发展关系的研究鲜有报道，本研究设计并筛选人外周血淋巴细胞HLA－B特异性引物，成功克隆了HLA－B功能基因，观察胃癌患者外周血淋巴细胞HLA－B mRNA及HLA－B抗原表达情况，为肿瘤的基因诊断和基因治疗提供有价值的临床指标。
材料与方法
一、材料
1. 研究对象：2003.03－2003.07 山东大学齐鲁医院普外科住院病人，经手术前胃镜或术后病理学检查确诊的胃癌病人30例，男22例，女8例，年龄36－78岁，中位年龄56.8岁。其中未出现淋巴结转移的高分化腺癌5例，淋巴结转移的低分化腺癌25例；正常对照取自山东大学齐鲁医院健康职工查体者，均无既往胃病史。
2. 主要试剂与仪器：逆转录酶、Taq酶及WBC裂解液（深圳匹基生物公司馈赠）；淋巴细胞分离液（上海华精生物公司）；琼脂糖试剂（美国Sigma公司）；鼠抗人HLA－B McAb及PE标记羊抗鼠IgG1（美国BD公司）；GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder（上海生物工程公司）。Biometra 梯度PCR扩增仪、Sunrise电泳仪、Bioemetra凝胶图象分析系统、EPTENDORF紫外分光光度计（德国Whatman公司）；HERMLE Z383K 低温高速离心机（德国HERMLE公司）；ABI PRISM 377－96全自动DNA测序仪（美国PE公司）；FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）。
二、方法
1. 引物设计与合成：据Genebank公布的HLA－B基因序列，参阅相关文献[1，2]，设计HLA－B特异性引物（深圳匹基生物公司合成），并进一步筛选、验证其工作情况。
2. PBL RNA的提取及鉴定：外周血淋巴细胞总RNA提取参阅《分子克隆》相关方法［3］，并在此基础上加以改良。提取的RNA在EPTENDORF紫外分光光度计上测定260nm和280nm波长吸光度及RNA浓度，1.5％琼脂糖甲醛变性电泳，鉴定所提取的RNA纯度及完整性。
3. RT－PCR扩增：逆转录反应体系25ul，其中逆转录酶1ul，Taq酶0.2ul，primer1、primer2各0.4ul，RNA 15ul。PCR反应参数为42℃ 30 min；95℃ 3 min；94℃ 1 min；55℃ 1 min；72℃ 1 min，5个循环。94℃ 10 sec；60℃ 40sec；40个循环。72℃ 5 min。
4. 扩增产物电泳扫描及序列分析：将上述PCR扩增产物于2％琼脂糖凝胶上电泳扫描，cDNA 以BigDye terminator v2.0为测试试剂，在ABI PRISM 377－96型全自动测序仪上测序，并在互联网上用Blastn服务器对序列进行查询和比较。
5. HLA－B mRNA及HLA－B抗原在胃癌中的表达：提取40例正常对照及30例不同类型胃癌病人PBL总RNA并调整其浓度，以β－actin作内参照，用RT－PCR方法检测HLA－B mRNA表达；用流式细胞术观察HLA－B抗原在胃癌中的表达情况。
6. 统计学方法：平均荧光强度以均数±标准差表示，例数分析以百分比表示，使用SPSS 10.0 for windows统计软件t检验及X2检验进行统计学处理。
结 果
1. PBL总RNA鉴定：提取的正常人PBL RNA在EPTENDORF紫外分光光度计测定，其吸光度均值为A260／A280＝1.87，平均浓度
为262.7ug/ml，1.5％低熔点琼脂糖变性电泳可见5s，18s，28s三条清晰条带，表明所提RNA浓度较纯，且RNA完整无裂解，可用于RT－PCR。
为262.7ug/ml，1.5％低熔点琼脂糖变性电泳可见5s，18s，28s三条清晰条带，表明所提RNA浓度较纯，且RNA完整无裂解，可用于RT－PCR。 2. 扩增片段序列分析：扩增片段HLA－B cDNA 在Genbank Blastn 服务器在线查询比较显示，与已知序列具有99.3％符合率，说明已经成功获得了表达外周血淋巴细胞HLA－B功能的目的基因。
3. 正常人PBL HLA－B mRNA的表达：40例正常人PBL HLA－B mRNA 经RT－PCR扩增，琼脂糖电泳图谱显示35例呈现特异性的强亮带（图2），与预期287 bp片段相吻合，其阳性表达率为87.5％。
4. 胃癌病人PBL HLA－B mRNA
及HLA－B抗原的表达：30例胃癌病人中HLA－B mRNA 表达缺失者23例，占胃癌病人的76.6％（23／30）；表达明显降低者5例，占16.7％（5／30）。其中，25例低分化转移胃癌中HLA－B mRNA未表达者21例，占84％（21／25），5例高分化未转移胃癌中3例呈现低表达状态（60％。3／5），2例表达缺失（图3）。与正常人相比，胃癌病人外周血中淋巴细胞HLA－B mRNA阳性表达率（23.3％，7／30）明显低于正常人（87.5％，35／40），统计学分析具有显著性差别（P＜0.01）。
及HLA－B抗原的表达：30例胃癌病人中HLA－B mRNA 表达缺失者23例，占胃癌病人的76.6％（23／30）；表达明显降低者5例，占16.7％（5／30）。其中，25例低分化转移胃癌中HLA－B mRNA未表达者21例，占84％（21／25），5例高分化未转移胃癌中3例呈现低表达状态（60％。3／5），2例表达缺失（图3）。与正常人相比，胃癌病人外周血中淋巴细胞HLA－B mRNA阳性表达率（23.3％，7／30）明显低于正常人（87.5％，35／40），统计学分析具有显著性差别（P＜0.01）。 20例不同类型的胃癌病人间标法HLA－B流式细胞仪检测结果显示（见表1），高分化未转移胃癌病人外周血淋巴细胞HLA－B抗原表达阳性率（88.20％）与正常对照（98.84％）相比，虽然无显著性差异（P＝0.056），但存在明显下降趋势；而低分化伴淋巴结转移胃癌（73.26％）则差异显著（P＜0.05）。以平均荧光强度（MFI）分析，高分化未转移胃癌病人MFI（55.27±2.41）及低分化转移胃癌病人MFI（25.73±1.87）与正常对照相比均存在非常显著性差异（P＜0.01）。表明胃癌患者外周血淋巴细胞HLA－B抗原表达下调，且与其分化、转移有关。
讨 论
在人类基因组中，编码HLA－Ⅰ类分子的基因组成包括124 HLA－A、258 HLA－B和74 HLA－C［4］，其中HLA－B表达最多（56.6％）。研究表明肿瘤细胞表面HLA－Ⅰ类分子，尤其是HLA－B表达下降或缺失，是逃避CTL杀伤，导致肿瘤逃避机体免疫监视的机理之一[5]。以往对HLA－Ⅰ类分子的研究多集中于肿瘤细胞表面，如David R.[6]对乳腺癌、大肠癌病人检测结果显示肿瘤细胞表面HLA－Ⅰ类分子表达分别降低88％和73％，且与肿瘤细胞表面HLA－B mRNA相关较好（r2＝0.80）。本课题前期研究中也得到类似结论［7，8］。
但肿瘤细胞表面HLA表达是肿瘤细胞的特性，而宿主血液白细胞HLA表达的变化，则反映了全身HLA状态，代表了宿主的免疫特性。其HLA表达的强弱，一定程度上表示了机体辨别异己的能力。本研究根据HLA－B基因结构特点［9，10］及相关文献，合成针对HLA－B保守区的引物加以筛选，RT－PCR扩增、凝胶电泳图谱显示表达了与预期结果相吻合的DNA片段，经DNA测序、计算机分析显示与Genebank公布序列高度符合，表明成功获得了 HLA－B表达的功能基因。应用于胃癌患者，结果显示胃癌患者PBL HLA－B mRNA表达率（23.3％）与正常人相比（87.5％），具有非常显著差异（P＜0.01）。同时，流式细胞术检测发现高分化未转移胃癌病人PBL HLA－B抗原表达率（88.20％）
与正常对照（98.84％）相比，虽然无显著性差异（P＝0.056），但存在明显下降趋势；而低分化伴淋巴结转移胃癌表达率（73.26％）与正常相比则差异显著（P＜0.05）。以平均荧光强度（MFI）分析，高分化未转移胃癌病人MFI（55.27±2.41）及低分化转移胃癌病人MFI（25.73±1.87）与正常对照 （116.26±25.73）相比均存在非常显著性差异（P＜0.01）。提示胃癌患者PBL HLA－B mRNA 及HLA－B抗原表达下调与其分化、转移有关，而这种改变在肿瘤发生的早期就可能出现，并影响肿瘤的临床转归。其机理可能与细胞膜上HLA－B的脱落，修饰后装配和运输，或合成及调控等因素有关［11］。但PBL HLA－B基因及其编码的蛋白在肿瘤发生发展过程中的分子生物学机制，尚有待于进一步研究阐明。
与正常对照（98.84％）相比，虽然无显著性差异（P＝0.056），但存在明显下降趋势；而低分化伴淋巴结转移胃癌表达率（73.26％）与正常相比则差异显著（P＜0.05）。以平均荧光强度（MFI）分析，高分化未转移胃癌病人MFI（55.27±2.41）及低分化转移胃癌病人MFI（25.73±1.87）与正常对照 （116.26±25.73）相比均存在非常显著性差异（P＜0.01）。提示胃癌患者PBL HLA－B mRNA 及HLA－B抗原表达下调与其分化、转移有关，而这种改变在肿瘤发生的早期就可能出现，并影响肿瘤的临床转归。其机理可能与细胞膜上HLA－B的脱落，修饰后装配和运输，或合成及调控等因素有关［11］。但PBL HLA－B基因及其编码的蛋白在肿瘤发生发展过程中的分子生物学机制，尚有待于进一步研究阐明。 目前国内外检测HLA－B多采用组织化学法，较先进的使用流式细胞术。由于HLA－B具有高度的多态性，使用针对HLA－B 不同抗原决定簇的不同抗体，流式细胞仪测定结果存在差异。本研究根据HLA－B保守序列设计特异性引物，用RT－PCR方法检测PBL HLA－B mRNA表达，消除了不同抗体因素的影响，减少了误差。Liu K等［12］研究也显示RT－PCR检测肿瘤细胞表面HLA－B表达较流式细胞术更敏感。本实验表明从基因水平检测HLA－B mRNA表达较HLA－B抗原能更准确、更本质地反应与胃癌发生、分化和转移的关系。
参考文献
1 David R. Johnson，Barbara C，Biedermann，et al. Rapid cloning of HLA class Ⅰ cDNAs by locus specific PCR. Journal of Immunological Methods，2000，233：119－129.
2 Peter Krausa，Jason B. Stein，Jan Capper，et al. DNA sequencing based typing HLA－B and HLA－C alleles：a strategy for analyzing exons 2 to 7. Human Immunology，2002，63：s42.
3 萨姆布鲁克 D. W. 拉塞尔等，分子克隆实验指南[M]. 北京：科学出版社，2002，518－522.
4 Bodmer JG，Marsh SG，Albert ED，et al. Nomerclature for factors the HLA system. Human Immunol. 1998，60：361－368.
5 Maeurer MJ，Gollin SM，Martin O，et al. Tumor escape from immune recognition[J]. Clin Invest，1996，98：1633－1642.
6 David R. Johnson. Differential expression of human major histocompatibility class Ⅰ loci：HLA－A，－B，and －C. Human Immunology，2000，61：389－396.
7 杨晓静，邹雄，王传新.外周血单个核细胞中乙型肝炎病毒感染与细胞表面HLA－I类抗原表达的关系探讨. 中华医学杂志，2002，82：1499－50.
8 Chunxia Wang，Xiong Zou，Lanfang Wang，et al. Expression of MHC antigen in tissues and peripheral blood lymphocytes of patient with gastric carcinoma，J of tumor marker oncology 18（1），2003，37－46.
9 Jason B. Stein，Malcolm D. McGinis，Jan Capper，et al. Complete intron and exon sequence of eight HLA－B and HLA－C variants. Human Immunology，2002，63：s42.
10 The MHC Sepuencing Consoutium. Complete sequence and gene map of a human major histocompatibility complex. Nature，1999，401（6756）：921－923.
11 C. Le Morvan，M cogne，M droute. HLA－A and HLA－B transcription decrease with ageing in perpheral blood leucocyte. Clin Exp Immunol. 2001，125：245－250.
12 Lin K，Kao KJ. Measurement of relative quantities of different HLA－A and －B mRNAs in cells by reverse transcription－polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electro－phoresis. J Immunol Methods，1997，203：67－75.
