韦三华，尹文，雷迎峰，胡兴斌，杨敬，吕欣，孙梦宁，徐志凯   第四军医大学学报  2006 年 1 月 第 26 卷 第 1 期

   　Establishment of stably transfected P815 cell line expressing multiepitope gene of hepatitis C virus

　　WEI SanHua, YIN Wen, LEI YingFeng, HU XingBin, YANG Jing, L Xin, SUN MengNing, XU ZhiKai

　　Department of Microbiology, School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, Xian 710033, China

　　【Abstract】 AIM: To construct a eukaryotic expression vector of HCV compound multiepitope gene and obtain a stably transfected P815 cell line. METHODS:  The cDNA sequence Ct encoding truncated HCV core gene lacking parts of the carboxylterminal region was amplified by PCR and inserted into shuttle plasmid pDE22. HCV multiepitope gene Em from E2 and nonstructual proteins were synthesized and inserted into pDE22. CtEm was obtained by BamHⅠ/Hind Ⅲ and cloned into the eukaryotic expressing vector pcDNA3.1(-) which was digested by BamHⅠ/Hind Ⅲ and the recombinant plasmid pcDNA3.1(-)CtEm was obtained. After sequencing, pcDNA3.1(-)CtEm was transfected to P815 with liposome and screened by G418 and obtained the stably transfeced cell line. RESULTS:  The eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-)CtEm was constructed, transfected to P815 and stably expressed HCV compound multiepitope gene, which was confirmed by RTPCR, IFA and Westernblot. CONCLUSION:  A eukaryotic expression vector of HCV compound multiepitope gene has been constructed, stably transfected cell line obtained and the target cells established for analyzing CTL function in the study of HCV vaccine.

　　【Keywords】 hepatitis C virus; epitope; eukaryotic expression；transfection

　　【摘要】 目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）多表位基因的真核表达载体，获得重组质粒稳定转染的P815细胞克隆. 方法：PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段Ct；合成HCV E2区模拟表位和NS3~NS5七个T细胞表位基因Em；分别克隆入穿梭质粒载体pDE22中. 用BamHⅠ/HindⅢ双酶切pDE22得到复合多表位基因CtEm，再将CtEm亚克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-)，构建重组质粒pCDNA3.1(-)CtEm，经酶切鉴定及测序正确后，通过脂质体转染至P815细胞，持续G418压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系，用RTPCR，IFA，Westernblot证实该稳定转染细胞系可以表达多表位基因. 结果：构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)CtEm，建立了稳定转染的P815细胞系. 结论：构建HCV多表位基因的真核表达载体，稳定转染P815细胞，为进一步在疫苗研究中分析 CTL功能建立了靶细胞.

　　【关键词】 丙型肝炎病毒；表位；真核表达；转染

　　0引言

　　丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）引起的. HCV高变异性使预防HCV感染的疫苗研制长期以来进展甚微，亟待开发有效的预防和治疗性疫苗. 我们利用基因重组技术，把含HCV截短C基因、HVR1模拟表位基因及NS3，NS4，NS5的优势Th与CTL表位基因串联，组成HCV复合多表位基因，构建入大肠分枝杆菌穿梭质粒，转化入BCG并筛选重组株，构建新型疫苗. 但由于HCV研究中缺乏细胞模型，使疫苗评价中缺乏靶细胞. 我们在构建穿梭质粒后，将复合多表位基因亚克隆入真核表达载体，转染P815细胞，为疫苗效果评价中CTL杀伤实验建立靶细胞.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　真核表达载体pcDNA3.1(-)，P815细胞、菌种DH5α均由本室保存. Trizol试剂购于Gibco公司.脂质体购于Invitrogen公司.  Taq DNA聚合酶、内切酶购于TaKaRa公司.  逆转录试剂盒购于Promega公司. RPMI Medium 1640培养基、异硫氰酸荧光素和辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG均购于华美公司. 含有HCVH株全基因组序列的质粒（pBRTM/HCV 1-3011）由美国华盛顿大学微生物学系Rice H教授惠赠.

　　1.2方法

　　1.2.1羧基端部分缺失的HCV C区基因扩增根据HCVH株C区基因序列设计特异性引物. 正向引物P1： 5′GCCGGATCCATGAGCACGAATCCTAAACCT3′，引入BamHⅠ酶切位点；反向引物P2：5′GCAAGCTTTTAGCCATGCGCCAGGGCCCT3′，引入PstⅠ酶切位点. PCR模板为pBRTM/HCV 1-3011,以引物P1, P2扩增HCV核心区氨基端144个氨基酸(432 bp). PCR产物胶回收,记作Ct.

　　1.2.2多表位基因的合成及连接参照文献［1］，选择E区的模拟表位和非结构蛋白区的优势表位，每个表位两端各保留3个氨基酸，各表位间用AAY分隔连接，以便于各表位保持独立性和能够有效呈递. 5′和3′端分别引入PstⅠ和 HindⅢ酶切位点. 全序列510 bp分成6段S1~S6，序列间添加交叉互补序列，合成后用PCR方法退火连接，得到全长的多表位基因序列Ep，克隆入PGEMTeasy载体，计作TEp.

　　1.2.3复合多表位基因与载体连接、转化及鉴定真核表达载体为pcDNA3.1(-)，先将PCR扩增得到的截短型C基因Ct用BamHⅠ/PstⅠ双酶切后，插入到大肠分枝杆菌穿梭质粒pDE22中的相应位点，构建pDE22Ct；再将多表位基因TEm用PstⅠ/HindⅢ双酶切后插入到pDE22Ct中的相应位点，构建成pDE22CtEm重组穿梭质粒，最后用BamHⅠ/HindⅢ将CtEm切下，连接入用同样双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(-)中，构建成重组真核表达载体pcDNA3.1(-)CtEm，不改变其编码区的框架结构. 重组质粒pcDNA3.1CtEm的鉴定采用双位点单酶切鉴定，酶切鉴定得到的阳性克隆送TaKaRa公司进行核苷酸序列测定，用生物软件pcgene分析汇总结果.

　　1.2.4细胞培养和G418工作浓度的筛选常规培养P815细胞于12孔板中，50 mL/L CO2，37℃，培养基为RPMI 1640 (100 mL/L胎牛血清,100 mg/L青、链霉素,2 mmol/L谷氨酰胺)，至细胞密度达80%布满时，加入含G418的培养液1 mL/孔（G418终浓度分别为100～800 mg/L，8孔）. 换液时保持G418浓度稳定不变，持续培养3～4 wk. 800，700，600 mg/L孔于第3日、 500，400，300 mg/L孔于第5日、200 mg/L孔于第6日开始出现生长抑制现象，细胞开始溶解. 20 d后，G418浓度≤300 mg/L的各孔细胞稳定生长，而≥400 mg/L的细胞孔相继全部死亡. 可以认为在本实验条件下G418的最佳工作浓度为300 mg/L.

　　1.2.5细胞转染与筛选稳定细胞克隆采用脂质体法转染,具体操作按LipofectAMINE 2000说明书进行. 转染48 h后细胞用胰酶消化，细胞计数，按每孔40个细胞转移至96孔板. 按终浓度300 mg/L加入含G418的100 mL/L RPMI 1640培养液，100 μL/孔，继续培养3 wk后，获得稳定生长的细胞克隆，将其依次转移至24孔板、6孔板和培养瓶扩大培养. 获得的细胞克隆冻存2 mo后复苏，检测细胞克隆的稳定性.

　　1.2.6RTPCR检测稳定转染细胞的mRNA将稳定生长的细胞用PBS清洗一次后，参照说明书用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，然后反转录合成cDNA，按SuperScriptTM II反转录试剂盒（Gibco公司）操作说明进行. 用引物P1和P2对反转录产物进行PCR.

　　1.2.7重组质粒在宿主细胞中表达的检测无菌盖玻片放入24孔板，用胰蛋白酶消化稳定生长的细胞，吹匀，将之加入24孔板中，37℃, 100 mL/L CO2孵育48 h后，取出盖玻片，冷丙酮固定15 min，吹干. 采用间接免疫荧光(IFA)方法， 用丙型肝炎患者阳性血清（1∶50稀释）作为一抗结合，37℃孵育1 h，PBS洗，吹干. 再加1∶50稀释的FITC标记的的羊抗人IgG，37℃孵育1 h，PBS洗，吹干. 荧光显微镜下观察. 同时以转染空载体的P815做为对照，伊文斯蓝衬染.

　　1.2.8Westernblot检测目的蛋白的表达收集稳定转染的细胞及未转染的对照组细胞，分别用冷PBS洗2次后，加入裂解缓冲液，水浴30 min后，将裂解物以12 000 g离心5 min，收集上清，样品蛋白经120 g/L SDSPAGE分离后，电转移到硝酸纤维素薄膜（滤膜孔径0.22 μm，转移条件为恒流、100 V，1 h）上，转印膜在50 g/L BSA中封闭过夜. 用丙型肝炎阳性患者血清作一抗，羊抗人IgG作为二抗，DAB（0.6 g/L）显色，至目的条带染色清晰时终止反应.

　　2结果

　　2.1截短型C基因及多表位基因Em的扩增以pBRTM/HCV 13011为模板，设计的引物P1，P2扩增后得到450 bp片段，与预期大小相符. 用S1和S6作为上下游引物对合成的表位基因退火连接产物进行PCR扩增得到全长的多表位基因序列Em，大小为510 bp，与预期大小相符（图1）.

　　2.2重组质粒pcDNA3.1(-)CtEm的鉴定pcDNA3.1(-)CtEm经BamHⅠ+HindⅢ双酶切得到948 bp的预期片段（图2）. 酶切鉴定的阳性克隆经测序与设计序列完全一致. 表明目的基因成功克隆入真核表达载体.

　　2.3RTPCR检测稳定转染细胞的mRNA用引物P1和P2对反转录产物进行PCR. 扩增后得到450 bp片段，与预期片段大小相符（图3）.

　　2.4重组质粒pcDNA3.1(-)CtEm在P815细胞中表达IFA检测结果见图4. 在重组质粒转染的

　　2.5目的蛋白的Westernblot在Mr 35 000处可见目的条带染色清晰（图5）.

　　3讨论

　　HCV感染过程中易产生变异株使其疫苗研究进展缓慢，需要开拓新的思路,发展有效克服HCV高变异性的新型疫苗. 我们构建了HCV复合多表位基因新型重组BCG疫苗. 为此，需建立能稳定表达该重组蛋白的靶细胞，为疫苗评价提供依据.

　　为使多表位基因能有效表达，我们在表位选择方面进行了优化组合. HCV核心区在各种基因型HCV中最为保守，其诱导的细胞免疫应答对于HCV感染的恢复起重要作用，对研制HCV疫苗有重要的应用价值［2-4］. 但核心蛋白所含碱性氨基酸较多，全长型核心蛋白很难获得稳定表达，而截短型核心蛋白，通过羧基端缺失去除疏水区对表达的影响，原核表达高效且稳定,在真核细胞中也有较高水平的表达［5］. HCV E区的中和抗原位点是产生体液免疫的关键区域，但HCV E2区存在高变区（HVR1）. 我们采用的HVR1模拟表位可使其抗原性更强、更广谱，与HCV感染患者血清的反应率可达53%~80%［6,7］. HCV非结构区存在多个优势Th与CTL表位，我们选择了NS3，NS4，NS5区的7个报道最多，经多种方法证实的Th与CTL优势表位串联，通过对间隔(spacer)序列的优化［8］，提高它们被加工递呈的效率，以期获得较好的免疫效果. 我们对多表位基因在原核系统进行表达，证实其能被稳定高效表达.

　　在疫苗的实验研究中，研究CTL的功能特性必需建立稳定、高效表达某种抗原的细胞系作为靶细胞. 目前HCV没有合适的细胞模型，因此需要建立HCV抗原特异性的靶细胞，我们将HCV重组真核表达质粒pcDNA3.1CtEm用脂质体法转染小鼠肥大细胞瘤P815，经G418筛选，有限稀释法筛选，获得了表达复合多表位基因的细胞克隆.该转染细胞克隆可作为研究细胞免疫的CTL杀伤实验的靶细胞，为进一步的基因免疫和新型BCG活载体疫苗的研究奠定了基础.

　　【参考文献】

　　［1］ Ward S, Lauer G, Isba R, et al. Cellular immune responses against hepatitis C virus: The evidence base 2002［J］. Clin Exp Immunol, 2002, 128:195-203.

　　［2］ DuenasCarrera S, Vina A, Martinez R, et al. Immunization with a DNA vaccine encoding the hepatitisCvirus structural antigens elicits a specific immune response against the capsid and envelope proteins in rabbits and Macaca irus (crabeating macaque monkeys) ［J］. Biotechnol Appl Biochem, 2004，39(Pt 2):249-255.

　　［3］ Isaguliants MG, Petrakova NV, Kashuba EV, et al. Immunization with hepatitis C virus core gene triggers potent Tcell response, but affects CD4+ Tcells［J］. Vaccine, 2004, 16;22(1314):1656-1665.

　　［4］ 冯志华,周永兴,贾战生，等. 丙型肝炎病毒核心基因免疫诱生细胞免疫应答研究［J］. 中华内科学杂志，1999，38（7）：462-465.

　　［5］ 胡刚，薛小平，董晓慧，等. 丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌中的表达［J］. 生物技术，2004，14（4）：4-5.

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　　［7］ Zhang XX, Deng Q, Zhang SY, et al. Broadly crossreactive mimotope of hypervariable region 1 of hepatitis C virus derived from DNA shuffling and screened by phage display library［J］. J Med Virol, 2003，71(4):511-517.

　　［8］ Velders MP,  Weijzen S,  Eiben GL, et al. Defined flanking spacers and enhanced proteolysis is essential for eradication of established tumors by an epitope string DNA vaccine［J］. J Immunol, 2001，166(9):5366-5373.

　　基金项目：国家自然科学基金（30371280）

　　通讯作者：徐志凯. Tel:(029)84774523 Email:zhikaixu@fmmu.edu.cn

　　作者简介：韦三华. 博士生（导师徐志凯）. Tel:(029)84774526
Email:bcvirus@fmmu.edu.cn
　　
　　（第四军医大学基础部微生物学教研室，陕西 西安 710033）

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