20世纪90年代开始实施的人类基因组计划（HGP），揭示了大量的基因序列，在基因的物质结构和遗传学上以及疾病与基因的关联上取得了很大的进展[1]。随着基因计划的完成，生命科学已进入后基因时代，研究的重点已从揭示生命所有遗传信息转移到从整体水平上对生物功能的研究
张青云1 孙丽2
1北京大学临床肿瘤学院，北京肿瘤医院检验科 北京市肿瘤防治研究所免疫研究室，北京 100036，
2锦州医学院生物化学与分子生物学教研室，锦州，121000
20世纪90年代开始实施的人类基因组计划（HGP），揭示了大量的基因序列，在基因的物质结构和遗传学上以及疾病与基因的关联上取得了很大的进展[1]。随着基因计划的完成，生命科学已进入后基因时代，研究的重点已从揭示生命所有遗传信息转移到从整体水平上对生物功能的研究。而以生命功能的主要执行者和体现者－－蛋白质为研究对象的蛋白质组学（proteomics）就显得越来越重要了。其中肿瘤蛋白质组学是从细胞整体水平上认识在肿瘤的发生、发展过程中蛋白表达谱的变化。为了达到这个目的，就需要高通量、快速简便的技术平台支持。蛋白质芯片SELDI-TOF MS（Surface Enhanced Laser Desorption and Ionization time-of-flight mass spectroscopy 表面增强激光解析电离－飞行时间－质谱）是一种新的蛋白质组学研究技术，正具有这种优势，可有效的应用于此项研究。本文综述了近年来SELDI－TOF MS在肿瘤蛋白质组学方面的应用及进展。
1 肿瘤蛋白组学的概念和研究内容
1994年澳大利亚的Wilkins[2]首先提出了蛋白质组（proteome）的概念：即基因组所表达的全部蛋白质。它有别于传统的单个基因或单个蛋白的研究模式，从机体或细胞的整体水平上来阐明生物体全部蛋白质的表达、修饰、结构功能和相互作用。因此产生了一个新的研究领域――蛋白质组学（protemics）。其中肿瘤蛋白质组学主要是比较分析肿瘤组织细胞与正常的组织细胞、肿瘤在不同发展时期的细胞内整体蛋白质的差异，获得肿瘤异质性的信息。肿瘤蛋白质组学研究的主要内容有：建立各种肿瘤的蛋白质组数据库、寻找肿瘤相关蛋白质、分析肿瘤相关蛋白质的结构和功能，鉴定出肿瘤标志物，进而为肿瘤诊断、治疗、预防以及发病机制的研究提供新的依据。
2 SELDI－TOF MS技术简介
其主要有三部分组成：蛋白质芯片（Protein Chip）、芯片阅读器（protein chip reader）和分析软件。
蛋白质芯片是SELDI－TOF MS的核心技术。根据芯片表面修饰的不同可分为：化学表面芯片和生物表面芯片。化学表面芯片又可分为疏水（hydrophobic surface ，H4）、亲水（normal phase，NP）、弱阳离子交换（weak cation exchange，WCX）、强阴离子交换（strong anion exchange，SAX）、金属离子鳌合（immobilized metal affinity capture，IMAC）等。这些芯片可以根据蛋白质的化学特性如疏水或亲水性及所带电荷而选择性的捕获特异蛋白质。其优点是①直接用粗生物样品进行分析，如血清，尿，体液②少量样品，只需0.5－5ul，或2000个细胞即可检测③高通量，操作自动化④可发现低丰度，小分子量蛋白质，并能测定疏水蛋白质特别是膜蛋白质⑤灵敏度高⑥同时快速发现多个生物标记物⑦在同一系统中集分离，纯化，鉴定，检测和数据分析为一体，快捷方便。而生物表面芯片可分为抗原－抗体、受体－配体、DNA－蛋白质、酶等芯片。其原理是抗原、抗体结合或供体、受体结合从而分离某一特异蛋白质。它的特点是①特异性高（如利用单克隆抗体芯片，可鉴定未知抗原/蛋白质，以减少测定蛋白质序列的工作量）②可以定量（如利用单克隆抗体芯片，由于结合至芯片上的抗体是定量的，故可以测定抗原量，但一般飞行质谱不能用于定量分析）；③功能广（如利用单克隆抗体芯片不仅可替代Western Blot，还可以弥补流式细胞仪不足的功能，如将细胞溶解，可测定细胞内的抗原，而且灵敏度和特异性远高于流式细胞仪）。
芯片阅读器，就是激光解析电离飞行时间质谱仪。其通过激光脉冲辐射将样品转化为运动的气态离子并按质荷（M/Z）大小进行分离，根据不同质荷比在电场中飞行时间长短不一，从而绘制出一张质谱图。
分析软件，是用来处理实验所得的数据。通过对已知数据进行差异性分析，从而发现有鉴别意义的峰值变化。
3 SELDI－TOF MS技术操作步骤
首先，被分析的样品直接点样到芯片阵列进行反应，样品中的蛋白特异性结合到具有生化特性的“芯池”上进行反应。然后冲洗芯片，把未结合的蛋白和非特异性结合的蛋白洗脱掉，从而除去了样品“噪声”。在剩下的特异结合的蛋白质样品中加入基质（能量吸收物质 energy absorbing molecule，EAM），当激光照射芯片时，它能把激光的能量转化为热能。样品中的蛋白质吸收能量后，被解吸而发生离子化。这些离子化的蛋白质在电场力的作用下，通过真空管飞到离子检测器，其中最小的离子化蛋白质飞得最快而最先到达离子检测器而被确定[3]。这样质荷比不同其飞行时间不同，所以不同的蛋白质即可根据质荷比而被分离。
4 SELDI－TOF MS技术在肿瘤组学中的应用
4.1 筛选肿瘤标志物
SELDI－TOF MS可以高通量的筛选肿瘤不同发展阶段基因表达的各种蛋白质，尤其是组织与体液中所含有的与肿瘤相关的低丰度蛋白，从而发现大量有诊断价值的蛋白标志分子，为肿瘤筛检提供众多的标志物，联合多种标志物进行肿瘤的筛检将有望提高筛检的特异性与敏感性。该技术已用于卵巢癌、膀胱癌等新型潜在肿瘤标志物的筛选。
4.11 卵巢癌：卵巢癌患者中约80％在中晚期被确诊，5年生存率仅有35％，而在早期（Ⅰ期）患者中，5年生存率超过90％，因此提高Ⅰ期诊断率，对降低卵巢癌患者死亡率、提高生存率很有必要。ＣＡ125是目前普遍使用的卵巢癌生物标记物，但仅有50％～60％的Ⅰ期卵巢癌患者ＣＡ125阳性，其作为一个单一的标记物的阳性预测值还不到10％，联合超声检测，阳性预测值也仅为20％。Ardekani等[4]认为卵巢内发生的病理变化能够在血浆中的生物标记物中得以反映。他们运用SELDI 质谱，在血浆中发现了很少量的能区别正常人群和卵巢癌病人的关键蛋白质。Petricoin等[5]应用SELDI蛋白质芯片技术及生物信息学对66例健康妇女、50例卵巢癌患者血清中的蛋白质进行簇分析（cluster analysis），并建立簇分析模型。 结果质/荷比在534，989，2111，2251和2465处的5个峰同时变化并对诊断具有重要意义，其中仅2251峰下调。应用该模型对来自正常、早期和晚期卵巢癌以及良性疾患妇女血清样品进行盲法分析预测，灵敏度为100％，特异性为95％，阳性预测值为94％。与此同时，将相同样品用ＣＡ125法进行检测，其阳性预测值为35％。美国国家癌症研究所（NCI）已应用该方法单独或联合其他筛查方法检测Ⅰ期卵巢癌的试验。2004年，这项技术在美国已开始应用于卵巢癌的筛查。
4.12 膀胱癌：膀胱肿瘤为泌尿系最常见肿瘤，由于其易复发性，随访（反复膀胱镜检）显得尤为重要。而寻找无创性的诊断、随访方法一直是膀胱肿瘤研究的热点。为发现膀胱癌中的蛋白标记，利用这种新的差异蛋白质组学技术，Vlahou等[6]发现了在膀胱癌中特异的蛋白质指纹。在研究中，来自具转移膀胱癌病人的尿液被SELDI－TOF MS 技术检测并与对照组（健康者的尿液）作比较，最后在患者尿中检测到新的蛋白质峰，检测率达到78％，与传统的细胞学法检测率33％相比，检测率明显提高，从而证明了SELDI－TOF MS技术可以有效的用于膀胱癌的早期诊断。M.D.Anderson 癌症研究中心的研究者用SELDI技术从膀胱鳞状上皮细胞癌（SSC）病人尿样中发现特异性表达蛋白质，如角蛋白10，13，15和19。同时发现这些病人的尿样中缺失一些蛋白质，如谷胱甘肽—S—转移酶，从而为SSC病人的检测提供方法[7]。
4.13 前列腺癌：Brynmor和Watkins等[8]利用对36个患有前列腺癌的男性血清和健康对照组血清样品分析，发现了前列腺癌特异表达的蛋白质 50.8ｋＤ蛋白。而用传统的PSA方法检测这些前列腺癌患者时，有8个患者未被检测出，说明利用SELDI－TOF MS技术筛选出的蛋白标记 50.8ｋＤ蛋白比PSA方法具有高的检测率，更有助于前列腺癌的早期诊断。SELDI－TOF MS技术还可通过免疫测定的方法诊断癌症患者。在蛋白质芯片上用特异抗体修饰，研究者可以捕获和检测到特异的蛋白质。例如，有的学者已成功的利用SELDI－TOF MS技术进行PSA和体液中前列腺表面抗原的免疫检测。利用SELDI－TOF MS 技术定量在血清中特异的表面抗原水平，Xiao等[9]精确地从良性前列腺增生（BPH）患者中鉴别出前列腺癌患者。
4.14 乳腺癌：在乳房疾病中，乳腺癌是最常见和最重要的疾病，根据肿瘤病理资料统计，乳腺癌的发病率占全身各种恶性肿瘤的7％～10％，而且发病率逐渐增高，已超过宫颈癌而成为妇科疾病中发病率最高的恶性肿瘤。在寻找乳腺癌早期诊断的蛋白标记的实验中，Watkins等[10]通过对15个恶性乳腺癌样品和15个健康的对照组样品进行血清蛋白分析，发现了一种分子量为28.3ｋＤ的蛋白质，经鉴定为核基质蛋白66（nuclear matrix protein 66，ＮＭＰ66）.作进一步研究，证实了ＮＭＰ66蛋白在转移、晚期和早期乳腺癌中的检测率达到100％，成为有效的乳腺癌早期诊断标记物。Ｌｉ等[11]利用SELDI－TOF MS技术也发现了乳腺癌中有效的蛋白标记。
4.15 肾癌：由于肾脏位置较隐蔽，早期常无明显临床症状，且缺乏临床可实用的肾癌诊断、监测用标记物，极易延误诊断，因此寻找肾癌相对特异性瘤标很有必要。Eggeling等[12]用SELDI技术结合蛋白质芯片研究8例肾细胞癌（RCC）组织（包括正常组织、外周癌组织和中心癌组织），4例子宫颈上皮细胞瘤组织，3例子宫颈癌组织。用H4芯片发现RCC组织过度表达11951.2Da及12019.9Da蛋白质。用SAX2芯片发现RCC组织过度表达12027Da蛋白质，但低表达10205Da、10953D及12738Da蛋白质。从而为RCC病人的检测提供方法。
4.16 肺癌： 我国高校蛋白质组学研究院成员之一——北京师范大学蛋白质组学中心何大澄教授[13]用SELDI技术从30名患者和相应数量的健康人血样品中成功筛选出15个肺癌标志分子，为肺癌诊断技术的发展提供了关键性的基础，将大大改变我国目前所有对肺癌临床检测手段，都要待病灶形成后才能检测出来的状况，能够在人体甚至细胞未出现任何病变，仅从蛋白质的变化中即可检测出癌变前兆。
4.17 大肠癌：Roboz等[14]采用SELDI TOF MS，选择疏水性芯片（H4）分析了大肠癌患者与正常对照血清蛋白图谱之间的差异，其中相对分子质量为8.9 kD的蛋白在大肠癌患者中高表达，而9.3 kD的蛋白呈低表达，正常对照组上述两个蛋白的表达情况与患者组正好相反。实验结果表明8.9kD和9.3 kD蛋白质可作为检测大肠癌的肿瘤标记物。
4.2辅助肿瘤组织病理分型
Yanagisawa等[15]通过分析肺癌和正常肺组织的蛋白质图谱，建立了分型预测模型。应用这一模型对37例肺癌和6例正常肺组织标本进行盲法测试，以评估用该模型进行肺癌组织学分型及区别原发瘤和转移瘤的准确性。结果准确率达85％。由15个明确质谱峰组成的蛋白质图谱还可对非小细胞肺癌术后预后情况进行评价。
基础研究
Diamond 等[16]使用SELDI 蛋白质芯片技术对正常B细胞分泌的蛋白质和EB病毒转化的B细胞分泌的蛋白质进行质谱分析，发现转化后的B细胞系有一过度表达的质荷比为4972.1的蛋白质峰值，通过逆相层析技术和胰蛋白酶消化，肽段相对应的片段被确认为胸腺素beta－4。Wu等[17]用SELDI 蛋白质芯片和二维电泳对头颈部肿瘤培养细胞系的转移相关蛋白进行了研究，通过对头颈部鳞状细胞癌培养细胞系UM－SCC10A 和UMSCC10B（前者来自原发部位而后者来自同一病人转移性淋巴结）的分析发现，在转移性淋巴结培养细胞系中的两种膜相关蛋白（层粘连蛋白Ⅰ和Ⅱ）和糖酵解蛋白α烯醇化酶是上调的，而calumenin 前体则是下调的，从而提示SELDI 蛋白质芯片是检测肿瘤发展和演进过程中异常蛋白表达的重要手段。
5 问题与展望
蛋白质芯片 SELDI TOF MS技术已经开始在各种肿瘤的研究中得到应用，但仍有其技术上的不足。经过质谱检测出来的蛋白质不能直接进行鉴定，蛋白质的鉴定还需要依赖传统的蛋白质鉴定方法；小分子量蛋白质的检测仍然没有像大分子量蛋白质检测那么容易[18]。蛋白质的鉴定将来很大程度上依赖高效完善的数据库，因此建立完整而无冗余的蛋白质数据库是肿瘤蛋白质组学发展的关键因素之一。目前，SELDI 蛋白芯片技术的发展应着重于：（1）肿瘤的分子分期标志物的研究，对肿瘤进行分子分期将有助于肿瘤的个体化治疗；（2）联合多种肿瘤标志物，根据蛋白质谱或基因表达谱的改变进行多变量分析，客观地分析和判断病情；（3）寻找无创或微创方法进行肿瘤的早期诊断和风险人群筛查；（4）肿瘤转移的早期诊断。蛋白质芯片 SELDI TOF MS技术是蛋白质组学研究中有力的技术平台，今后利用该技术在肿瘤学领域广泛开展蛋白质组学研究，将会带动肿瘤学新的发展。
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