王红兵，王绪，刘永彪，郝兴芝 《徐州医学院学报》 2006 年 4 月 第 26 卷 第 2 期
摘要 :目的 研究白细胞介素6（IL-6）对照射小鼠脾淋巴细胞亚群自然杀伤活性的影响。 方法 BALB.C小鼠分为照射组、对照组和照射+IL-6组，采用Panning法从小鼠脾淋巴细胞中分离L 3 T 4 、Lyt 2 和B细胞，用 3 H-TdR释放实验检测脾淋巴细胞亚群自然杀伤活性。 结果 照射+IL-6组与对照组比较， 3 H-TdR释放量有显著性差异（P<0.01）。 结论 IL-6具有促进照射小鼠脾淋巴细胞亚群活性作用。
关键词 :小鼠;分次照射;淋巴细胞;白细胞介素6;自然杀伤活性;K562;S180
The effects of IL-6on the natural killing activity of spleen lymphocyte subsets in irradiated mice
WANG Hong-bing，WANG Xu，LIU Yong-biao，et al
（Department of Oncology，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu221002，China）
Abstract:Objective To study the effects of IL-6on the natural killing activity of spleen lymphocyte subsets in irradiat-ed mice.Methods The spleen lymphocytes in irradiated mice were separated into L3T4，Lyt2and B cells by a panning meth-od.The natural killing activity of spleen lymphocytes was determined by means of 3 H-TdR release assay.Results Significant differences in 3 H-TdR release were found between the IL-6group and the control group（P<0.01）.Conclusion IL-6is able to stimulate the killing activity of spleen lymphocyte subsets in irradiated mice.
Key words:mice;fractional irradiation;lymphocyte;IL-6;natural killing activity;K562;S180
白细胞介素6（IL-6）是一种生物活性非常广泛的细胞因子［1］ ，可作用于淋巴细胞，诱导其增殖、分化和生长，还可以通过增强细胞间识别分子的表达，诱发肿瘤细胞对效应细胞的杀伤敏感性增强。我们已证实IL-6对脾淋巴细胞亚群有辐射保护作用［2］ ，IL-6是否同时具备促进脾淋巴细胞亚群免疫活性作用?我们就此进行了如下实验。
1 材料和方法
1.1 实验动物和肿瘤细胞株 6周左右的纯品系BALB.C雄性小鼠，体重（20±2）g，由中科院上海实验动物中心提供。K562细胞、S180细胞由中科院上海细胞所提供。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及处理 实验小鼠随机分为3组（n=6）。①照射组:只照射。②照射+IL-6组:于放射后30min尾静脉注射小鼠rIL-6（法国产，苏州大学孔向容博士惠赠）400μg·kg -1 ·d -1 。③对照组:于放射后30min尾静脉注射白蛋白400μg·kg -1 ·d -1 。照射方法为西门子直线加速器（Simens，USA）对小鼠全身照射，剂量率1Gy.min。剂量分割8Gy.1Gy.8d。
1.2.2 脾淋巴细胞亚群的分离和鉴定 动物处理结束后将各组BALB.C小鼠活杀，无菌条件下取脾脏，立即制备脾细胞悬液，采用Wysocki等建立的Panning直接法［3］ 分离淋巴细胞亚群。
用RPMI1640培养液将脾细胞悬液调成0.5×10 10 个.L，加到无菌培养皿（Corning，USA）中，每皿加5ml，37℃静置90min，吸取非贴壁细胞，RPMI1640洗2次，即为去单核的单个核细胞（mononuclear cell，MNC），备用。
收集贴壁细胞并计数，供亚群细胞培养用。分别加100μl McAbL 3 T 4 （Sigma）、100μl McAbLyt 2 （Sig-ma）于培养皿中，立即加3ml0.05mol.LTris-HCl缓冲液（pH9.5），摇匀后置于4℃下90min，吸弃上清，用0.01mol.L PBS（pH7.2）洗3次，再用含1%小牛血清的0.01mol.L PBS洗1次，并静置10min来封闭皿的剩余结合位点，最后再用0.01mol.L PBS洗1次，4℃放置备用。
将分离的MNC按每皿2×10 7 个细胞加入皿中，4℃放置90min，洗去非贴壁细胞，加入RPMI1640培养液，收集黏附细胞即分别得到L 3 T 4 和Lyt 2 细胞。采用间接免疫荧光试验加入羊抗鼠Ig-FITC（华美生物工程公司）和台盼蓝拒染法分别对所获细胞作纯度和存活率鉴定。结果表明，L 3 T 4 、Lyt 2 细胞 的纯度、存活率均在90%以上。
用Panning间接法［3］ 分离B细胞，将MNC按0.5×10 10 个.L加5ml于包被羊抗鼠-Ig（华美生物工程公司）的培养皿中，用荧光二抗同样方法鉴别，纯度在90%以上。台盼蓝拒染法鉴定B细胞存活率在90%以上。
1.2.3 靶细胞处理 取对数生长期的K562、S180细胞3ml，加入 3 H-TdR1.2×10 4 Bq（中国原子能科学院），37℃培养6h，PBS液洗3次，然后用RPMI1640培养液配成1×10 9 个.L细胞悬液，备用。
1.2.4 各亚群的肿瘤杀伤活性测定 每个培养瓶内加入靶细胞1×10 5 个，将获得的L 3 T 4 （5×10 5 个.瓶）、Lyt 2 （5×10 5 个.瓶）、L 3 T 4 +B细胞（2种细胞各为2.5×10 5 个.瓶）、Lyt 2 +B细胞（2种细胞各为2.5×10 5 个.瓶）分别加到培养瓶中（n=6），同时设单纯靶细胞组对照。37℃继续培养16h，分组收获细胞，Beckman液体闪烁仪（LS-6800，USA）测cpm值。按下式计算亚群细胞肿瘤杀伤活性:
亚群细胞肿瘤杀伤活性（cpm.5×10 5 细胞）=单纯靶细胞组cpm-实验组cpm
上式得到的差值即表示各亚群细胞破坏肿瘤细胞所释放的cpm值。该值越大，说明对肿瘤杀伤活性越强（即被杀死的肿瘤细胞越多），反之则越弱。
1.3 统计学处理 数据用ˉx±s表示，t检验进行差异显著性分析，P<0.01有统计学意义。
2 结果
2.1 各组小鼠脾淋巴细胞亚群对K562细胞杀伤活性测定 结果见表1。
2.2 各组小鼠脾淋巴细胞亚群对S180细胞杀伤活性测定 结果见表2。
表1 各组小鼠脾淋巴细胞亚群对K562细胞杀伤活性测定（略）
与对照组、照射组比较:*P<0.01
表2 各组小鼠脾淋巴细胞亚群对S180细胞杀伤活性测定（略）
与对照组、照射组比较:*P<0.01
3 讨论
本实验将3组BALB.C小鼠活杀，无菌条件下取脾脏，立即制备脾细胞悬液后Panning直接法、间接法分离脾淋巴细胞亚群（L 3 T 4 、Lyt 2 和B细胞），通过 3 H-TdR释放实验检测了L 3 T 4 、Lyt 2 细胞单独培养，L 3 T 4 细胞与B细胞、Lyt 2 细胞与B细胞混合培养时的肿瘤杀伤活性。结果显示，脾淋巴细胞亚群单独培养、混合培养时，照射+IL-6组与对照组比较， 3 H-TdR释放量均有明显差异（P<0.01），表明IL-6提高了脾淋巴细胞亚群肿瘤杀伤活性。
业已证实，IL-6对脾淋巴细胞亚群有辐射保护作用［2，4］ ，再结合本实验研究结果，可以得出这样的结论:IL-6提高了受分次照射的BALB.C小鼠脾淋巴细胞亚群肿瘤杀伤活性，IL-6具有保护和促进淋巴细胞免疫活性作用。
IL-6是一种多途径发挥生物活性的细胞因子，主要作用于淋巴细胞和肿瘤细胞，又可与其他细胞因子相互调节。IL-6促进脾淋巴细胞亚群免疫活性，提高脾淋巴细胞亚群肿瘤杀伤活性，可能的机制［5］ 是IL-6在活体内不直接杀伤肿瘤细胞，但可以通过增强细胞间识别分子的表达，激发免疫活性细胞对肿瘤细胞的免疫反应，而诱发肿瘤细胞对免疫细胞的杀伤敏感性增加。
参考文献 :
［1］ Sehgal PB.Interleukin6in infection and cancer［J］.Proc Soc Exp Bi-ol Med，1990，195（2）:183-191.
［2］ 王红兵，王 绪，刘永彪，等.IL-6对受分次照射的荷瘤小鼠脾淋巴细胞、亚群及其调节的保护效应［J］.中国肿瘤临床，2001，28（12）:934-936.
［3］ Jambou RC，Snouwaert JN，Bishop GA，et al.High-level expression of a bioengineered，cysteine-free hepatocyte-stimulating factor（in-terleukin6）-like protein［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1988，85（24）:9426-9430.
［4］ Kishimoto T.The biology of interleukin-6［J］.Blood，1989，74（1）:1-5.
［5］ 林飞卿主编.医学基础免疫学［M］.上海:上海科技出版社，1993:30-56.
本文编辑 :孙立杰
（徐州医学院附属医院肿瘤科，江苏徐州221002;徐州医学院肿瘤研究所，江苏徐州221006）
