王毓洲,武永吉,张之南 中国实验血液学杂志
摘要 阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH) 克隆可能由于缺乏GPI 锚连蛋白而逃脱免疫攻击,形成生长优势。本研究测定PNH患者淋巴细胞增殖反应及对K562 细胞的杀伤作用,并与正常对照比较,观察其淋巴细胞功能。采用体外液体培养体系,应用免疫磁珠技术分选PNH 患者骨髓CD34 + 及CD34 - 细胞,分别向2 组细胞及对照细胞加入自身CD59 + 或CD59 - 淋巴细胞及其培养上清液、外源性IFN2γ及IL22。培养10 天后,测定骨髓细胞中PNH细胞(CD59 - ) 百分数,观察淋巴细胞对骨髓中CD34 + 及CD34 - 细胞中PNH细胞含量的影响。研究结果表明,对PHA 的增殖反应,PNH患者未分选的淋巴细胞与健康对照比较、PNH 患者自身CD59 + 与CD59 - 淋巴细胞之间比较均无统计学差异,但对K562 细胞的杀伤作用PNH患者未分选的淋巴细胞明显低于健康对照组,分别为(50. 00 ±28. 67) %及(76. 13 ±10.15) %( P < 0. 05) ,而PNH患者CD59 - 淋巴细胞与CD59 + 淋巴细胞之间无显著性差异。PNH 患者骨髓细胞中加入自身CD59 - 淋巴细胞或其培养上清液、CD59 + 淋巴细胞或其培养上清液、外源性IFN2γ和IL22 培养后,CD59 + 细胞均有不同程度下降,除CD59 + 淋巴细胞组外,其他各组CD59 + 细胞下降与培养前比较有显著性差异( P < 0. 05) ,IFN2γ及IL22组下降更明显( P < 0. 01) 。结论:PNH患者淋巴细胞的增殖能力虽无异常,但其淋巴细胞杀瘤活性下降。自身淋巴细胞及培养上清液、IFN2γ及IL22 对PNH患者的正常表型(CD59 + ) 细胞可能有抑制作用,使CD59 - 细胞增多。免疫调控紊乱与PNH发病机制有关。
关键词 阵发性睡眠性血红蛋白尿症; 淋巴细胞; 骨髓细胞
中图分类号 R556164 文献标识码 A
Proliferation and Anti2tumor activity of Lymphocytes and Their Effect on Normal Phenotype of Autologous Bone Marrow Hematopoietic Cells in Patients with Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria
WANG Yu2Zhou , WU Yong2Ji , ZHANG Zhi2Nan
Department of Hematology , Peking Union Medical College Hospital , Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College , Beijing 100730 , China
Abstract There is a hypothesis that paroxysmal nocturnal hemoglobinuria ( PNH) hematopoitic stem cells are resistant to the cytotoxic effect of T cells because they lack glycosyl phosphatidylinositol (GPI)2linked proteins. The aim of this study is to investigate
proliferation and anti2tumor activity of lymphocytes in patients with PNH , and also to assay the effect on normal cell(CD59 + ) phenotype in bone marrow of PNH patient by autologous lymphocytes in vitro. MTT assay for detection of lymphocytes proliferation and its anti2tumor effect was driven to delineate T cell reactive function. The CD34- and CD34 + bone marrow cells ( selected by means of immunomagnetic method) as well as unsorted marrow cells in PNH patients were cultured together with autologous CD59+ or CD59 - lymphocytes , their cultured supernatant , extrinsic IFN2γand IL22 in a liquid culture system. CD59+ cells were counted by flow cytometry after 10 day culture in vitro. The results showed that there were no differences in the proliferation ability of lymphocytes between each group : controls 1. 42 ±0. 46 , unsorted PNH lymphocytes 1. 40 ±0. 35 , CD59 - 1. 30 ±0. 40 , and CD59+ PNH lymphocytes 1. 40 ±0. 42. Anti2tumor effect of lymphocytes declined in PNH patients when compared with control [(50. 00 ± 28. 67) % vs. ( 76. 13 ±10. 15) %] . The proportion of CD59+ cells diminished significantly after culture with autologous lymphocytes , their supernatant , extrinsic IFN2γor IL22 ( P < 0. 01) in groups of unsorted , CD34+ and CD34 - bone marrow cells.No significant difference was found between groups of CD59- and CD59 + lymphocytes , or CD34- and CD34 + marrow cells. It is concluded that turbulences of immune regulations may be involved in pathogenesis of PNH.
Key words paroxysmal nocturnal hemoglobinuria ; lymphocyte ; bone marrow cell
阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal he2moglobinuria , PNH) 是一种后天获得性造血干细胞异
常所致的溶血病,目前认为该病系造血干细胞X 染色体上的PIG- A 基因发生突变引起糖基磷脂酰肌醇(GPI) 锚合障碍,使GPI 锚连蛋白缺乏。在正常人群中,可有少量PNH 的细胞克隆,由于该克隆无形成生长优势的条件,因此通常不会扩展,将被免疫系统清除[1 ] 。PNH 的细胞克隆可以从影响其他骨髓细胞的损伤因素作用下被筛选出来。许多PNH 患者有骨髓衰竭,推测PNH 细胞得以生长,形成优势克隆及造血,可能源于免疫细胞对干细胞的损伤,而PNH 细胞克隆由于缺乏某些表面分子而逃脱T 细胞的攻击,得以生存发展[2 ] 。为了解PNH 患者外周血淋巴细胞增殖、杀瘤活性以及对骨髓中正常表型CD59 + 细胞的生成有无影响,我们进行了本实验。
材料与方法
研究对象
PNH 患者系我院门诊和住院病人,共16 例(男13例,女3 例) ,年龄(47 ±18) 岁。均经Ham 实验,流式细胞术等检查确诊。检查前1 个月无感染病史,3个月内未服用肾上腺皮质激素类药物。健康对照19 例均为健康献血者(男14 例,女5 例) ,年龄(32 ±6) 岁。经肘静脉穿刺取外周血10 ml ,肝素抗凝。外周血单个核细胞(PBMNC) 的分离PNH患者及对照组外周血,以PBS 缓冲液稀释,加于Ficoll (密度为1. 077 gPml) 的液面上,400 g 密度梯度离心30 分钟。收集界面层单个核细胞,PBS 洗涤3 次后悬于含10 %胎牛血清的PRMI 1640 培养基的培养瓶中,于37 ℃5 %的CO2 孵箱中培养2 小时,去除粘附细胞后备用。
间接免疫磁珠法分离纯化CD59 + 及CD59 - 细胞患者PBMNC 悬于含0. 5 % BSA ,2 mmolPL EDTA 的PBS(pH 7. 4) 内,加入鼠抗人CD59 单抗( PharMin2gen) ,混匀后4 ℃孵育20 分钟,加入羊抗鼠单抗标记的免疫磁珠(Miltenyi Biotec) ,混匀后4 ℃孵育20 分钟,30μm 尼龙膜过滤。将细胞加于MiniMACS 分离柱顶,使其缓缓通过分离柱,洗脱收集CD59 - 细胞后,将分离柱移出磁场,加1 ml 缓冲液于柱顶,加使CD59 + 细胞洗脱,收集CD59 + 细胞,洗涤3 次,并分别计数。
未分选的淋巴细胞和CD59 +PCD59 - 淋巴细胞增殖反应
未分选淋巴细胞和CD59 +PCD59 - 淋巴细胞置于96孔细胞培养板中,每孔加入1 ×105 个细胞,每组设5个复孔。实验组共2 组,分别加入T 细胞有丝分裂原PHA 2. 5 或5μgPml (终浓度) ,另设5 孔不加入有丝分裂原作为细胞增殖的本底对照(对照组) 。37 ℃,5 % CO2 及饱和湿度的条件下培养68 小时,每孔加入0. 5 % MTT 20μl 培养72 小时后,离心弃上清,洗涤。加入DMSO 100μl ,10 分钟后在酶标仪上以测定波长570 nm ,参照波长625 nm 读取OD值:
淋巴细胞增殖反应活性= 实验组平均OD 值P对照组平均OD 值
活化T淋巴细胞对K562 细胞的杀伤作用
将1 ×108Pml 生长旺盛期的K562 细胞置- 20 ℃冷冻24 小时后,37 ℃融化,反复3 次,作为K562 靶细胞抗原。
淋巴细胞激活: CD59 - PCD59 + 及未分选的淋巴细胞中,每106 细胞加上述处理的K562 细胞抗原100μl ,并加入PHA 2. 5μgPml ,培养72 小时。将CD59 - PCD59 + 及未分选的淋巴细胞分组加于96 孔细胞培养板中,每孔加入100μl 细胞悬液(1×105 个细胞) ,每组设5 个复孔,实验组加入2 ×104生长旺盛的K562 细胞100μl ,淋巴细胞对照组加入PMRI 1640 培养基100μl ,肿瘤组另设5 孔加入同浓度的K562 细胞100μl 及培养基100μl 。
培养24 小时后,应用MTT 比色法测定淋巴细胞杀瘤活性。结果计算如下:
淋巴细胞杀肿瘤活性=[ 1 -(实验组平均OD 值- 淋巴细胞对照组平均OD 值)肿瘤组平均OD 值]×100 %
淋巴细胞及其培养上清、IFN2γ 和IL22 对骨髓
CD34 +PCD34 - 细胞培养扩增后CD59 +PCD59 - 细胞增殖的影响
将PNH 患者的骨髓细胞经Ficoll 法(同PBMNC 的分离) 去除红细胞,计数。
应用免疫磁珠技术( 同上, 但单抗为鼠抗人CD34) 分选为CD34 +PCD34 - 细胞,洗涤后将CD34 +PCD34 - 细胞分别计数,加入IMDM 完全培养基中(含20 %胎牛血清,10 - 5molPL 22巯基乙醇,2 mmolPL L2谷氨酰胺,GM2CSF 10 ngPml 及G2CSF 20 ngPml) 。分别将CD34 + 细胞及CD34 - 细胞分为8 组,每组设2 个复孔,分别加入20 % CD59 + 淋巴细胞、20 % CD59 -淋巴细胞、20 % CD59 + 淋巴细胞培养的上清液、20 %CD59 - 淋巴细胞培养的上清液、IFN2γ2 000 UPml 、IL22 10 UPml 、20 %健康对照淋巴细胞培养的上清液及IMDM培养基。
3 天换培养液1 次,10 天后应用流式细胞仪测定每组骨髓细胞中CD59 + 细胞的百分数及记录流式细胞仪检查时的每分钟细胞流量,作为反映细胞增殖的间接指标。
统计方法
应用SPSS 10. 0 统计软件进行t 检验、卡方检验和方差分析。数值以平均值±标准差( ?x ±s) 表示。
结 果
淋巴细胞增殖反应
对照组淋巴细胞增殖活性为1. 42 ±0. 46 ,PNH患者未分选淋巴细胞为1. 40 ±0. 35 ,两者无显著性差异, ( t 检验, P > 0. 05) 。PNH患者CD59- 及CD59+ 淋巴细胞增殖活性分别为1. 30 ±0. 40 及1140 ±0. 42 ,两者之间亦无显著性差异,(配对t 检验, P > 0. 05) 。
活化淋巴细胞对K562 细胞的杀瘤活性
对照组淋巴细胞对K562细胞的杀瘤活性为(76.13 ±10.15) %,PNH患者未分类淋巴细胞为(50.00 ±28.67) %,两者相比有显著性差异( t 检验, P 值<0. 001) 。但PNH患者的分选后CD59- 淋巴细胞及CD59+ 淋巴细胞对K562 细胞杀伤活性分别为54149±27.12及54.08±24.07,两者之间无差异(配对t 检验, P >0.05) 。
淋巴细胞对骨髓细胞CD34 +PCD34 - 细胞中CD59 +细胞含量的影响
PNH 患者骨髓CD34 + 与CD34 - 及未分选的骨髓单个核细胞在加入各类淋巴细胞及淋巴细胞培养上清液后,用流式细胞术检查CD59 + 细胞百分数,各组(包括非PNH 患者) 之间与培养前、后比较见表1 ,各组大多数培养后CD59 + 百分数下降,有显著性差异( F 检验, P > 0. 05) 。加入IFN2γ及IL22 后CD59+百分数下降最明显,与其他组比较有显著性差异。
淋巴细胞对骨髓细胞增殖的影响
PNH患者CD34 + 与CD34 - 骨髓细胞及未分选骨髓单个核细胞在加入自体CD59 + ,CD59 + 淋巴细胞及其淋巴细胞培养上清液10 天后,根据流式细胞术检查时的细胞流量估算细胞增殖情况。细胞流量(细胞数P分钟) 各组之间比较见表2。各组培养后CD34 + 组细胞数均明显上升,有显著性差异( F 检验, P < 0. 05) 。加入IFN2γ及IL22 后细胞流量与其他各组比较最低,其他组之间比较有显著性差异( P < 0105) 。
讨 论
骨髓造血系统与免疫系统一样,为一复杂的网络系统,存在诸多正负调节因素。PNH 患者造血细胞缺乏GPI 锚连蛋白,包括一些与免疫有关的蛋白,如CD59 ,CD58 ,CD55 ,CD16 ,CD14 ,LFA23 和CD48 等,推测存在免疫异常。我们应用MTT 比色法, 比较CD59 + 和CD59 - T 淋巴细胞及健康对照淋巴细胞对PHA 的增殖反应性,各组之间无显著性差异。而应用K562 细胞抗原及PHA 激活淋巴细胞后,观
Table 1 Proportion of CD59+ cells in bone marrow cell after culture with autologous lymphocytes , their cultured supernatant , andextrinsic cytokines( ?x ±s)(略)
Table 2 The proliferation ability of bone marrow cell after culture in different condition(略)
察对K562 细胞的杀伤作用,发现PNH 患者明显低于健康对照组,但CD59 + 与CD59 - 淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用无明显差异。鉴于免疫功能检查具有复杂及多样变化的特点,PNH 患者临床差异又较大,贫血、输血、反复感染、一些治疗均可造成免疫功能的损害[3 - 5 ] ,因此对PNH 患者免疫功能低下的评价尚需进一步研究。
大多数学者认为,PNH 患者CD59 - 细胞克隆较CD59 + 造血干细胞有生存优势。此种生长、生存优势使PNH 成为有临床表现的疾病。细胞毒T 细胞通过释放细胞因子,如Th1 细胞释放的IFN2γ和IL22及Th2 细胞释放的IL24 等对CD34 + 细胞的增殖有抑制作用[6 ] ,虽然认为PNH 细胞克隆因免疫逃逸而发生发展,但免疫细胞对PNH 细胞的调控目前国内外报道尚少。Merchav 等[7 ] 检测了无骨髓衰竭的PNH患者骨髓体外BFU2E 生长率,去除T 细胞后,BFU2E增加了4. 5 倍。有报道淋巴细胞活化与骨髓衰竭有关[8 ] 。我们将健康对照者淋巴细胞培养的上清液,PNH 患者激活的CD59 + ,CD59 - 淋巴细胞及其培养的上清液分别加入到PNH 患者CD34 + 和CD34 - 骨
髓细胞中,在液体培养基中培养,10 天后行流式细胞术测定CD59 细胞,观察到培养后CD59 + 细胞有减少趋势, IFN2γ及IL22 组减少更明显。通过流式细胞仪细胞流量估算细胞增殖情况,进一步发现细胞增殖受到不同程度的抑制, IFN2γ及IL22 组受抑制更明显。CD59 +PCD59 - 淋巴细胞及其培养的上清液、健康者淋巴细胞上清液之间比较无显著性差异。这些结果提示,在淋巴细胞存在时, PNH 干细胞可能由于表面抗原的缺失逃脱T 细胞的攻击,而正常细胞群则受到不同程度的抑制,随着培养的时间延长,数量逐渐减少。IFN2γ为造血的负调节因子,可刺激骨髓细胞尤其使CD34 + 细胞表达Fas 抗原,通过FasPFasL 使CD34 + 细胞凋亡[9 ] 。IL22 可刺激细胞毒T 淋巴细胞的作用而抑制骨髓,我们实验发现,这两种细胞因子在体外可显著抑制骨髓细胞,并使CD59 + 细胞减少。因此,淋巴细胞在PNH 患者造血过程中有调控作用,免疫因素与PNH 的发病机制有
关,值得进一步研究。
参考文献
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中国医学科学院、中国协和医科大学、北京协和医院血液科,北京100730
