本文摘自《转基因植物安全性评价及检测技术培训班资料汇编》
作为现代科技飞速发展的产物，转基因食品几乎涉及国际食品贸易的各个方面，不仅使得各国对食品安全问题倍加关注，而且其引起的贸易争端更是对世贸组织争端解决机制的严峻挑战。在我国，由于检测技术和设备落后，国外大量转基因产品在我们毫不知情的情况下涌入国内。如 2000 年我国进口大豆 1040 万吨，其中大部分为转基因大豆，对国产大豆生产造成巨大冲击。
2001 年 5 月 23 日，国务院发布了新的第 304 号令《农业转基因生物安全管理条例》，在该条例的第四章第二十八条明确规定了在中华人民共和国境内销售列入农业转基因生物目录的农业转基因生物，应当有明显的标识。虽然我国已经公布了转基因农产品标签制度，但是实际检测中仍然存在一定问题，如缺乏系统的、完整的、统一的转基因农产品检测和监控技术体系等。这些都在一定程度上影响了我国转基因标签制度的实施。建立规范、准确、快速的转基因成分检测技术，是加入 WTO 后在进出口贸易中维护国家利益的重要保障。
尽管在不同样品（原材料、食品成分、加工产品）中， DNA 是一个相对稳定的分子，但是对于深加工产品来说， DNA 提取技术仍然是基于 DNA 扩增的转基因检测技术的瓶颈。本文关于转基因检测试验的主要内容包括：利用试剂盒对转基因植物及其深加工（大豆油、酱油、腐乳及玉米淀粉）的 DNA 提取方法，转基因成分（主要针对 Monsanto 公司抗除草剂大豆 Roundup Ready Soybean 的 35s 、 Nos 、 EPSES 及 Lectin ）的 PCR 检测等。
• 材料和试剂
1 材料
Monsanto 公司转基因抗草甘膦大豆（ Roundup Ready Soybean ）与对照非转基因大豆；市售福临门牌大豆色拉油；市售和田宽牌黄豆酿造酱油；市售广中皇老牌腐乳皇；市售长林牌玉米淀粉。
2 试剂
植物基因组 DNA 提取试剂盒、大豆油 DNA 提取试剂盒、酱油 DNA 提取试剂盒、腐乳 DNA 提取试剂盒、淀粉 DNA 提取试剂盒，由中国农业科学院生物技术研究所提供。 Taq DNA 聚合酶及其缓冲液购自申能博采公司， dNTPs 购自六合通公司。
• PCR引物
引物由上海生工生物有限公司合成，其核苷酸序列和片段长度见表 1 。
表 1 Monsanto 公司转基因抗草甘膦大豆 35s- EPSES 、 Nos 基因及大豆内标基因的引物及目标片段
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基因 |
引物 |
片段大小 |
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35s- EPSES |
5’-TGGCGCCCATGGCCTGCATG-3’ 5’-CCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATA-3’ |
目标片段 为 509bp |
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EPSES -Nos |
5’-GCGAAGATCGAACTCTCCG-3’ 5’-TGATAATCATCGCAAGACCGG-3’ |
目标片段 为 147bp |
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Lectin |
5’-GCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3’ 5’-GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3’ |
目标片段 为 118bp |
二． DNA提取方法
• 植物样品 DNA提取操作程序
• 取适量的样品放在研钵中，加入液氮将样品研磨成粉末，称取约 70mg-100mg 磨碎样品转入 1.5ml 的离心管中；
• 加入 1ml Extraction Buffer Ⅰ，轻轻混匀；
• 室温下 12,000rpm 离心 5 分钟；
• 去掉上清，加入 500μl Buffer Ⅱ和 Buffer Ⅲ重新悬浮，混匀；
• 65 ℃水浴保温 15 分钟；
• 12,000rpm 离心 10 分钟，吸取上清到另一新的离心管中；
• 加入 2 倍体积无水乙醇；混匀， 4 ℃放置 10 分钟后， 12,000rpm 离心 10 分钟，去上清，保留沉淀；
• 在沉淀中加入 100 μl Elution Buffer, 于 37 ℃充分溶解沉淀， 5 分钟后加 300 μl Buffer Ⅳ，上下颠倒 10 次，充分混匀；
• 离心柱放置在一个 2ml 的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置 2 分钟；
10) 离心柱和 2ml 套管一起用 8,000rpm 离心 30 秒，弃去 2ml 套管中的溶液，在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
11) 在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
12) 在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
13) 在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
14) 12,000rpm 离心 30 秒，去除离心柱中痕量残余溶液；
15) 将离心柱放置在一个新的 1.5ml 离心管中（离心管请自备），在离心柱底部中央小心加入 50 μl Elution Buffer, 于 Buffer ， 37 ℃放置 2 分钟后， 12,000rpm 离心 30 秒；若需提高得率，可在在离心柱底部中央小心加入 50 μl Elution Buffer, 于 Buffer ， 37 ℃放置 2 分钟后， 12,000rpm 离心 30 秒；
16) 离心管中的溶液即可作为 PCR 反应的摸板。建议一个 PCR 反应使用 0.5 μl DNA, 其余样品在 -20 ℃保存备用。
2 . 大豆色拉油DNA提取操作程序
• 取 20ml 精炼大豆色拉油加入 20ml Buffer Ⅰ，磁力搅拌器充分混匀， 2 小时；
• 加入 40ml Buffer Ⅱ，磁力搅拌器充分混匀， 2-3 小时；
• 4 ℃， 12,000rpm 离心 20 分钟，小心移去油相；
• 加入等体积 Buffer Ⅲ与 4 μl Buffer Ⅳ，混匀，常温放置 10 分钟后， 12,000rpm 离心 20 分钟，弃上清，保留沉淀；
• 加入 1 ml Elution Buffer 溶解沉淀，加入 1ml 异丙醇，混匀，常温放置 10 分钟后， 12,000rpm 离心 20 分钟，弃上清，保留沉淀；
• 在沉淀中加入 100 μl Elution Buffer, 于 37 ℃充分溶解沉淀， 5 分钟后加 300 μl Buffer Ⅴ，上下颠倒 10 次，充分混匀；
• 取出离心柱，将离心柱放置在一个 2ml 的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置 2 分钟；
• 将离心柱和 2ml 套管一起用 8,000rpm 离心 30 秒，弃去 2ml 套管中的溶液，在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
• 在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
• 在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
• 在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
• 12,000rpm 离心 30 秒，去除离心柱中痕量残余溶液；
• 将离心柱放置在一个新的 1.5ml 离心管中（离心管请自备），在离心柱底部中央小心加入 50 μl Elution Buffer, 于 Buffer ， 37 ℃放置 2 分钟后， 12,000rpm 离心 30 秒；若需提高得率，可在在离心柱底部中央小心加入 50 μl Elution Buffer, 于 Buffer ， 37 ℃放置 2 分钟后， 12,000rpm 离心 30 秒；
• 离心管中的溶液即可作为 PCR 反应的摸板。建议一个 PCR 反应使用 0.5 μl DNA, 其余样品在 -20 ℃保存备用。
• 腐乳DNA提取操作程序
• 取一块腐乳放在研钵中，加入液氮将样品研磨成粉末，将磨碎样品转入 50ml 的离心管中；
• 加入 15mlExtraction Buffer Ⅰ，充分混匀；
• 20 ℃， 12,000rpm 离心 5 分钟；
• 去掉上清，加入 10ml Buffer Ⅱ和 4ml Buffer Ⅲ，充分混匀；
• 65 ℃水浴保温 15 分钟
• 20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，吸取上清到另一新的离心管中；
• 加入等体积氯仿，轻轻混匀；
• 20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，吸取上清到另一新的离心管中；
• 加入等体积异丙醇（自备），混匀；
10) 常温放置 10 分钟后， 20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，弃上清，保留沉淀；
11) 在沉淀中加入 100 μl Elution Buffer, 于 37 ℃充分溶解沉淀， 5 分钟后加 300 μl Buffer Ⅳ，上下颠倒 10 次，充分混匀；
12 ）将离心柱放置在一个 2ml 的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置 2 分钟；
13 ）将离心柱和 2ml 套管一起用 8,000rpm 离心 30 秒，弃去 2ml 套管中的溶液，在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
14 ）在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
15 ）在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
16 ）在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液； 17 ） 12,000rpm 离心 30 秒，去除离心柱中痕量残余溶液；
18 ）将离心柱放置在一个新的 1.5ml 离心管中（离心管请自备），在离心柱底部中央小心加入 50 μl Elution Buffer, 于 Buffer ， 37 ℃放置 2 分钟后， 12,000rpm 离心 30 秒；
19 ）离心管中的溶液即可作为 PCR 反应的摸板。建议一个 PCR 反应使用 0.5 μl DNA, 其余样品在 -20 ℃保存备用。
• 酱油DNA提取操作程序
• 取一块腐乳加入 63ml Buffer Ⅰ，充分混匀于 250ml 的离心管中；
• -20 ℃下静置 10 分钟；
• 4 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，；
• 加入 15ml Buffer Ⅱ，磁力搅拌器充分混匀， 2-3 小时；
• 吸取溶液与 50ml 的离心管中， 20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，弃上清；
• 加入 10ml Buffer Ⅲ和 4ml Buffer Ⅳ重新悬浮；
• 65 ℃水浴保温 30 分钟
• 20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，吸取上清到另一新的离心管中；
• 加入等体积氯仿，轻轻混匀；
10) 0 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，吸取上清到另一新的离心管中；
11) 加入等体积氯仿，轻轻混匀；
12) 常温放置 10 分钟后， 20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，弃上清，保留沉淀；
13) 在沉淀中加入 100 μl Elution Buffer, 于 37 ℃充分溶解沉淀， 5 分钟后加 300 μl Buffer Ⅳ，上下颠倒 10 次，充分混匀；
14) 将离心柱放置在一个 2ml 的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置 2 分钟；
• 将离心柱和 2ml 套管一起用 8,000rpm 离心 30 秒，弃去 2ml 套管中的溶液，在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
• 在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
• 在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
• 在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
• 12,000rpm 离心 30 秒，去除离心柱中痕量残余溶液；
• 将离心柱放置在一个新的 1.5ml 离心管中（离心管请自备），在离心柱底部中央小心加入 50 μl Elution Buffer, 于 Buffer ， 37 ℃放置 2 分钟后， 12,000rpm 离心 30 秒；
• 离心管中的溶液即可作为 PCR 反应的摸板。建议一个 PCR 反应使用 0.5 μl DNA, 其余样品在 -20 ℃保存备用。
• 玉米淀粉DNA提取操作程序
• 称取 2g 加入 20ml Buffer Ⅰ，充分混匀；
• 20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟；
• 加入 10ml Buffer Ⅱ，充分混匀；
• 20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟；
• 加入 10ml Buffer Ⅲ和 4ml Buffer Ⅳ，充分混匀；
• 65 ℃水浴保温 30 分钟
• 20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，吸取上清到另一新的离心管中；
• 加入等体积氯仿，轻轻混匀；
• 20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，吸取上清到另一新的离心管中；
10) 加入等体积异丙醇，混匀；
11) 常温放置 10 分钟后， 20 ℃， 12,000rpm 离心 10 分钟，弃上清，保留沉淀；
12) 在沉淀中加入 100 μl Elution Buffer, 于 37 ℃充分溶解沉淀， 5 分钟后加 300 μl Buffer Ⅳ，上下颠倒 10 次，充分混匀；
13) 取出离心柱，将离心柱放置在一个 2ml 的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置 2 分钟；
14) 将离心柱和 2ml 套管一起用 8,000rpm 离心 30 秒，弃去 2ml 套管中的溶液，在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
15 ）在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅰ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
16 ）在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
17 ）在离心柱中加入 200 μl Wash Buffer Ⅱ ,8,000rpm 离心 30 秒，弃溶液；
18 ） 12,000rpm 离心 30 秒，去除离心柱中痕量残余溶液；
19 ）将离心柱放置在一个新的 1.5ml 离心管中（离心管请自备），在离心柱底部中央小心加入 50 μl Elution Buffer, 于 Buffer ， 37 ℃放置 2 分钟后， 12,000rpm 离心 30 秒；
20 ）离心管中的溶液即可作为 PCR 反应的摸板。建议一个 PCR 反应使用 0.5 μl DNA, 其余样品在 -20 ℃保存备用。
二． PCR扩增方法
1 35s- EPSES的PCR检测
1) 反应体系：
Taq 酶 0.5 μl (2unit)
Taq Buffer 10 ＊ 5.0 μl
DNTPs 4.0 μl
引物 -1 2.5 μl
引物 -2 2.55 μl
DNA 1.0 μl
水 33.5 μl
2) 反应程序： 96 ℃ /2 分钟，（ 96 ℃ /30 秒， 65 ℃ /1 分钟）× 30 个循环， 72 ℃ /3 分钟；
3) 凝胶电泳： 2% 琼脂糖， 100V, 60 分钟。
2 PSES- Nos的PCR检测
1 ）反应体系：
Taq 酶 0.5 μl (2unit)
Taq Buffer 10 ＊ 5.0 μl
DNTPs 4.0 μl
引物 -1 5.0 μl
引物 -2 5.0 μl
DNA 1.0 μl
水 29.5 μl
2 ） 反应程序： 94 ℃ /5 分钟，（ 95 ℃ /1 分钟， 62 ℃ /30 秒 ,72 ℃ /30 秒） 40 个循环， 72 ℃ /3 分钟；
3 ）凝胶电泳： 2% 琼脂糖， 100V, 60 分钟。
3 Lectin引物反应条件：
1 ）反应体系：
Taq 酶 0.5 μl (2unit)
Taq Buffer 10 ＊ 5.0 μl
DNTPs 4.0 μl
引物 -1 5.0 μl
引物 -2 5.0 μl
DNA 1.0 μl
水 29.5 μl
2 ） 反应程序： 96 ℃ /2 分钟，（ 94 ℃ /30 秒， 62 ℃ /30 秒 ,72 ℃ /30 秒） 40 个循环， 72 ℃ /3 分钟；
3 ）凝胶电泳： 2% 琼脂胶， 100V, 60 分钟。
