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1 引 言
对DNA的研究是生命科学领域中极为重要的内容，在人体组织、血液、微生物、病毒等样本中特定DNA序列的定量检测有着十分重要的意义，尤其对疾病的早期准确诊断及治疗举足轻重。DNA分子是多聚脱氧核苷酸，由碱基、脱氧核糖和磷酸三部分组成。特定DNA的碱基序列与其互补链的杂交，是各种测定DNA技术的基础[1]。已有许多方法被用于DNA的测定，经典的、应用比较广泛的是使用放射性同位素标记的方法，特别是用32P标记的方法应用普遍[2]。这类方法测定DNA有较高的灵敏度，然而它们亦存在明显的缺陷，主要是放射性标记物的辐射有损于操作者的健康，要在限定的实验室和设施下进行，操作很不方便；另外放射性物质半衰期短，故使用期限短。在研究者们的努力下，各种新的DNA检测技术不断出现，首先被显著改进的是采用非放射性物质做标记探针，如采用生物素、地高辛、荧光染料等[3-5]。但这些传统的方法都需要标记探针，花费时间长，操作复杂。聚合酶链反应（PCR）是目前应用最为广泛的测定DNA技术，它有很高的灵敏度，已被广泛的用于基因缺失和点突变的检测[6]。近几年，不断有DNA生物传感器的报道并引起研究者们极大兴趣。大多数专家认为：实现快速、简便、准确、价廉的DNA测定，最有希望的是利用生物传感器。
DNA传感器设计的依据是核酸杂交动力学，它的基本组成包括一个DNA探针和一个换能器[7]，每一种属生物体内都含有其独特的核酸序列，因此设计检测核酸的生物传感器的关键是设计一段寡核苷酸序列探针[8]。探针一般由若干个碱基的核苷酸组成，是一段单链核酸分子，其碱基序列与被测DNA片段的碱基序列互补，能够专一与特定的靶序列进行杂交，杂交过程具有很高的特异度和敏感度[9]。也有报道将dsDNA修饰在电极的表面，用以测定其它有机化合物。换能器的功能是将DNA探针与被测定DNA片段的杂交信息转换为可测量信号，根据杂交前后测量信号的改变量，分析出被测DNA的量。由于换能器的不同形成各种类型的DNA传感器，其中以采用电化学换能器的报道为多。
2 DNA生物传感器的类型
根据换能器的不同，DNA传感器主要有以下几种类型：
第一种类型是光学DNA传感器，这种传感器采用光学换能器。所采用的光学检测方式也有多种。目前报道比较多的有荧光光纤型、表面增强拉光谱（SERS）型、表面等离子体共振（SPR）镜型及物角反射光型等[10-12]。
生物发光（BL）和化学发光（CL）很早已被用于DNA检测，而后一些光学反应的利用与固定化技术的结合发展为各种类型的光学DNA传感器。Henke等[13]通过溴化乙淀杂交指示剂和全内反射荧光法测定光纤表面的杂交反应，研究了荧光光纤DNA传感器的制备；Grahan[10]报道了灵敏度达0.8pmol的利用表面增强拉光谱试剂修饰制备的表面增强拉曼基因探针。表面等离子体共振传感器基于SPR对传感器表面变化的敏感，无需杂交指示剂也不用标记DNA，可直接现场检测杂交过程。
第二种类型DNA传感器采用的是质量敏感型换能器，主要包括压电晶体和表面声波换能器。这些换能器的共同特点都是对表面质量变化敏感。压电晶体在制成后会有一个固定频率，当有少量物质附着于其表面后，它的共振频率会产生一个变化量，DNA传感器就是根据这个原理设计的。Fawcett[14]等在压电晶体表面利用疏水性共聚物交联固定了寡核苷酸探针，然后将其暴露在单链互补序列中，充分杂交后，检测其频率变化。压电基因传感器又称为体声波或石英晶体微天平基因传感器。表面声波直接测定法[15]是将单链寡核苷酸直接或间接地固定在换能器的表面上，它遇到被检测的互补链产生杂交后引起表面质量的增加，这种换能器对表面质量的增加相当敏感。
第三种类型是电化学DNA传感器，采用的是电化学换能器。电化学DNA传感器是根据固定在电极上的寡核苷酸与溶液中互补核酸杂交时，能引起电化学换能器的电压、电流或电导等电信号变化这个原理设计的，通过对电信号变化的检测可对样本中DNA的结构和含量等信息加以测定。电化学DNA传感器是目前研究者认为最有发展前景的一类DNA分析方法[16]。因为以电化学设计传感器有以下优点：受环境干扰少，不论浑浊或清澈样本，电信号的测量均不受干扰；电信号测量比较简单，不需要激光诱导或精密的分光器等装置；仪器成本低。
3 DNA片段在固体电极上的固定化方法
电化学DNA传感器一般先用玻碳电极、石墨电极、碳糊电极、汞电极、金电极等固体电极作基础电极，DNA探针片段要有效地与之结合，不脱落且保持活性，其结合量应满足灵敏度的需要。所以探针的固定化是重要环节，决定着传感器的性能。
3.1 吸附结合法
很多人研究了DNA片段的电化学行为以及在电极表面的作用行为，为制作DNA传感器奠定了工作基础。DNA片段很容易在电极表面发生吸附。热变性的单链DNA分子能强烈地吸附于汞电极表面，质子化的DNA亦如此，而单链DNA分子发生电还原反应后的还原产物的吸附能力为最强。Pang等[17]研究证明,ssDNA在汞电极上的吸附性质为化学吸附，生成吸附化学键。质子化的ssDNA分子通过嘌呤和嘧啶碱基上芳香杂环的π键键合而吸附到汞电极上。
Hashimoto等[18,19]采用吸附法在平面热解石墨电极上固定了DNA片段。方法是将抛光的平面热解石墨电极浸在浓度为10μg/ml DNA的NaCl溶液中，在100℃下放置30min,然后用100℃热蒸馏水冲洗电极，以除去表面吸着的未修饰上的DNA。他们[19]还通过化学吸附在金电极表面修饰了20mer的DNA探针，该探针与v-myc基因部分互补。
Erdem等[20]利用控制电位吸附法，将合成的单链寡核苷酸探针固定在碳糊电极（CPE）上。这个DNA探针序列能和乙肝病毒相关的DNA序列产生杂交。首先在0.05mol/L的磷酸盐缓冲液（Ph7.5）中提供+1.7v电位，无搅拌活化电极1min。探针的固定化通过将电极放入含有10-6DNA探针的20mmol/L的NaCl溶液中，在搅拌状态下提供+0.5v电位5min，然后再用灭菌水清洗10s。
3．2 共价键结合法
这种固定化方法首先要在电极表面修饰上一些活性官能团，如氨基，羧基等[21-23]。这些活性官能团与ssDNA产生共价键，由此将DNA片段修饰在电极表面。Liu等采用共价键法在石墨电极上固定了DNA探针，先将石墨电极抛光，经过1:1HNO3、丙酮洗涤、再用蒸馏水在超声振荡下清洗后，将石墨电极置于 K2Cr2O7与HNO3溶液中，在20mA电流下氧化10s，然后把电极放入氢化锂铝的乙醚溶液中1h，以使电极表面产生羟基。用乙醚冲洗电极后，将电极浸入3%的3-氨基丙基三氧基硅烷的甲苯溶液中24h,最后用甲苯冲洗电极。经以上步骤处理后，电极表面导入氨基。在修饰了氨基的电极表面上滴加50ul含有0.1mol/L DEC（乙基-3-二甲基丙基）碳二亚胺盐酸盐和0.1g /L ssDNA的0.1mol/L咪唑缓冲液（Ph 6.0），在35℃下，恒温3h, ssDNA便修饰在电极表面上，清洗电极以除去未共价固定化的ssDNA后，用红外灯烘干，保存于TE缓冲液。
Kelly等[24]用玻碳电极为基础电极，经氧化后以DEC和NHS（羟基丁二酰亚胺）作活化剂，在电极表面引入活性基团后以共价结合方式将含有20-mer的寡核苷酸片段固定在电极表面上。操作时首先用1～6μm颗粒的金刚石悬浮液将电极表面抛光，在水中超声波清洗。电极表面经氧化处理后，滴加DEC和NHS磷酸盐缓冲液，自然蒸发干燥。修饰电极经冲洗后放入含有20mmol/L DEC的5mmol/L Tris（Ph 6.0）中于4℃储存。
3.3 化学免疫法
首先在电极表面键合抗生蛋白（avidin），然后利用抗生蛋白与生物素之间的亲和作用，使其与5′端标记有生物素（biotin）的DNA结合，因而将DNA固定于电极表面，Yan等[25]利用avidin 与biotin的基本反应通过多层分子组装将dsDNA片段固定化用以测定小分子量有机物质和氯代联苯、氯代酚、双酚A、溴化乙啶等。
3.4 组合法
该法是将化学修饰剂与电极材料混合以制备组合修饰电极。Millan等[26]将18-烷基胺或18-烷基酸混入碳糊中，得到修饰的碳糊电极。在DEC存在下，18-烷基胺的氨基与ssDNA5′末端的磷酸基形成磷酰胺键，将其固定在电极上。
4 杂交指示剂
DNA传感器对目标基因的选择性识别是靠核酸的杂交来完成的。为了检测所发生的杂交信息，必须采用一种电活性物质来指示，这种电活性物质被称为杂交指示剂。它能选择性地与dsDNA结合，且仍然能保持其电活性，在电极上发生氧化还原反应，产生可测量信号。迄今报道的杂交指示剂主要有染料、抗生素及金属络合物类的物质。就杂交指示剂的作用方式而言，可分为嵌入剂、电活性标记物等。
4.1 嵌入式杂交指示剂
嵌入式杂交指示剂与DNA分子的作用，一是通过指示剂分子嵌入双链DNA双螺旋的碱基之间，二是通过指示剂分子与DNA骨架上的磷酸基之间的静电作用。比较有代表性的嵌入式杂交指示剂是蒽环抗生素类化合物，如道诺霉素、多柔比星、诺加霉素等。它们的共同结构特征是含有3个共平面的六元环所构成的四氢并四苯醌发色团。此外，也有染料、金属离子络合物等作为嵌入式杂交指示剂。Fang等[27]用多柔比星作杂交指示剂，测定了固定在石墨电极上的含有75个碱基的单链DNA-1的互补链DNA-2的浓度。DNA-2的浓度在1×10-5～5×10-7㎎/mL。用该方法检测了人体精子膜表面蛋白基因中的DNA。
4.2 电活性物质标记杂交指示剂
将电活性物质（如二茂铁、蒽醌、聚吡咯、聚噻吩等）标记在DNA探针上[27]。当探针与靶基因发生杂交时，电流强度会发生改变。Bauerle等[28]研究了碱基与聚噻吩的结合，首先观察单个碱基的作用，之后试验了15个碱基DNA与聚噻吩的作用情况，认为其作为杂交指示剂前景是乐观的。也有人研究了13个碱基的低聚核苷酸与聚吡咯的这种作用。发现将这种核苷酸连接到聚吡咯分子上，在水溶液中可使聚吡咯的电活性增强[29]。最近有报道采用胶体金纳米微粒作标记物来指示DNA的杂交[30，31]。从胶体金纳米粒子中可以释放出大量Au（Ⅲ）离子，然后用阳极溶出伏安法或电位溶出法测定Au（Ⅲ）的阳极溶出峰。
5 DNA传感器的应用
5.1 DNA传感器在环境监测中的作用
5.1.1 监测环境有机污染物 Wang等[32]报道了测定肼类化合物的电化学DNA传感器，灵敏度高，能测定1×10-9g/mL水中的不同肼类化合物。这种传感器基于监测DNA自身的电极响应在与肼类化合物作用前后的变化实现对肼类化合物的监测，无须指示剂和标记。将dsDNA修饰电极置于该类化合物中，由于N-甲基鸟嘌呤形成，引起鸟嘌呤峰减弱。对鸟嘌呤响应峰的抑制，与肼类化合物的浓度相关性很好，为监测环境微量肼类污染物提供了一种方便快捷的方法。
Wang等[33]研究了用于芳香胺类化合物测定的DNA传感器。他们利用双链DNA层与芳香胺之间的键合作用，设计了一种新型亲和电化学生物传感器，检测芳香胺类化合物的检测限可达到纳摩尔数量级。他们用该传感器检测了2-氨基萘、1-氨基蒽、2-氨基蒽等芳香胺类污染物，主要用于对天然地下水污染的检测，未受污染的地下水不产生检测信号峰。Wang等对DNA传感器在环境检测方面的应用做了较详细的综述[34]。
5.1.2 监测环境病原微生物 大肠杆菌（E.coli）是一种致病菌，常会引起腹泻等疾病。因此，食物、环境中大肠杆菌的定量监测十分重要。Wang等[35]利用丝网印刷转换器，研制了测定环境中E.coli DNA序列的电化学生物传感器。他们将一段25-mer的DNA探针固定在丝网印刷碳电极上。方法是将电极置于浓度5μg/ml 的DNA探针醋酸盐缓冲液（Ph 5.2）中，先在+1.8V下停留1min后在+0.5V下搅拌2min，然后用含有NaCl和磷酸盐的缓冲液（Ph 7.0）清洗，制作成了覆盖有探针的电极，再与E.coli DNA靶基因杂交，用Co(bpy) 33+作杂交指示剂，在Tris-HCl缓冲液中+0.5V电位下测量其电流值。借此测定了环境水样本中的E.coli。
5.2 DNA传感器在临床诊断中的应用
5.2.1 细菌及病毒感染类疾病诊断 在传统方法中，细菌感染是通过体外血液培养来诊断的，这需要几日甚至几十日的时间，严重延误了疾病治疗，利用DNA传感器可快速检测细菌和病毒。
Hashimoto等[36]利用光刻微细加工技术刻蚀出0.3mm的固定DNA探针微金属膜电极，研究了测定乙型肝炎病毒的传感器。将电极浸入含DNA探针和1mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液（Ph7.0）中，在室温下放置3h，通过5-磷酸巯已基的化学吸附作用，探针被固定在金电极上。乙型肝炎DNA靶序列在沸浴中热变性3min，杂交反应在43℃振摇下进行1h，反应后传感器置于100ulmol/L。Hoechst33258溶液中，闭光5min，用磷酸盐缓冲液冲洗后，观察Hoechst33258的阳极峰电流。Wang等[37]利用计时电位的测定方法，在碳糊电极上固定了两个长度分别为27和36碱基的DNA探针，此DNA探针与结核杆菌MTB(Mycobaterium tuberculosis)的ＤＲ区ＤＮＡ互补，可利用其杂交反应检测ＭＴＢ含量，选择杂交指示剂CO（phen）。
5.2.2 基因诊断 Millan等[38]用ssDNA修饰了碳糊电极，在较高离子强度下与靶基因快速杂交（<10min），用该传感器测定了18个碱基长度的囊性纤维变性基因△Ｆ508序列，得到令人满意的结果。
Wang等[39]报道了艾滋病人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-I）相关的短DNA序列测定的传感器。它们将21个和24个碱基与HIV-IU5LTR序列互补的单链寡核苷酸部分修饰在碳糊电极（CPE）上，以杂交指示剂（Cophen）的计时溶出峰来检测杂交，靶基因片段检出限为４×10-9mol/L。Wang等[40]又提出了以肽核酸（PNA）代替ssDNA作为探针修饰到电极表面，已证明PAN与互补和苷酸有很多杂交特性，在许多方面显示出优于ssDNA的性能，有望很好得用于基因诊断。
5.3在药物检验中的应用
DNA传感器在药物分析中的应用也越来越受到关注。Brett等[41]利用DNA修饰电极建立了对抗癌药卡铂(Carboplatin)的测定方法，工作电极选择了玻碳电极，用吸附法使DNA修饰在电极表面，测定血样本中卡铂检出为５.７mol/L。用该方法还可以测定其他铂类抗癌药。实验表明比起鸟苷来，卡铂更好地与DNA分子中的腺苷发生作用。
6 展 望
DNA生物传感器作为一类新的传感器正在快速的发展，由于它在医学、临床诊断、环境监测等领域中有着广泛的应用前景，倍受研究者的关注。但是，这种传感器尚存在易受干扰、重现性差等问题，仍限于实验室阶段。今后的研究目标主要是向使用化、小型化发展，并且在DNA固定化、信号转换等方面不断应用新技术，对传感器的性能进行改善和补充，使之更加适应实际应用的需要。
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