姜宏 李麓芸 卢光 中华医学实践杂志 2003年2卷4期
分子生物学实验中，常常需要从琼脂糖凝胶或聚丙酰胺凝胶中回收DNA，进行纯化、探针标记或进一步扩增等。鉴于PCR反应具有高度敏感性，微量模板即可扩增出阳性产物。我们从琼脂糖凝胶中直接回收DNA进行PCR，取得较满意的结果，报道如下。
1 材料和方法
1.1 试剂 Taq DNA聚合酶、dNTP、琼脂糖、PstⅠ内切酶、pUCm-T载体、E.coli JM109细菌购自上海生工生物工程公司，PCR-Select TM cDNA Subtraction Kit和Advantage cDNAPolymerase Mix购自Clontech公司。
1.2 方法
1.2.1 目的基因片段 由本室应用抑制消减杂交法获得 ［1］ ，片段大小约200～700bp。由于PCR产物的3’末端均带有一个多聚腺苷酸A，pUCm-T Vector设计了胸腺嘧啶T尾，可与PCR产物直接连接，并转化感受态细胞。将转化后的E.coli JM109细菌接种于含氨苄青霉素和IPTG-Xgal的LB琼脂培养基中，37℃培养过夜。从阳性克隆中挑取单个菌落，按常规碱裂解法提取小量质粒DNA ［2］ ，PstⅠ内切酶切，2%琼脂糖凝胶，100V电泳检测。
1.2.2 凝胶中DNA的快速回收 用刀片将琼脂糖凝胶中的特异性EB着色条带切下，置入含20μl双蒸水的Ep管内，用无菌吸嘴将凝胶捣碎，置4℃过夜。
1.2.3 PCR扩增回收DNA片段 由于小鼠生精细胞凋亡相关基因片段是采用抑制消减杂交法经巢式PCR扩增而得，故进行PCR扩增回收DNA时用的引物为巢式PCR的内侧引物:Nested PCR primer1∶5’-TCGAGCGGCCGCCˉCGGGCAGGT-3’和Nested PCR primer2R:5’-AGCGTGˉGTCGCGGCCGAGGT-3’。反应体系包括模板1～3μl，引物Nested1和Nested2R各0.4μl，dNTP（250μmol/L）0.5μl，Taq酶（2U/μl）1μl，10×PCR反应buffer1μl，补足水至反应体积10μl。在PE9600型PCR扩增仪上扩增，反应条件:94℃1min;94℃10sec，68℃30sec，72℃1.5min，30个循环，2%琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果
从凝胶中直接回收DNA进行PCR的结果见图1，图中可见阳性条带清晰，背景干净。M:pUC Mix marker;1～10:回收DNA的PCR扩增
图1 凝胶中直接回收DNA进行PCR的结果（略）
3 讨论
通常从凝胶中回收和纯化DNA的方法有压碎浸泡法、透析袋洗脱法和低熔点琼脂糖法。压碎浸泡法与本法虽有相似之处，但须反复洗脱和DNA抽提，操作繁琐;透析袋洗脱法不仅须反复洗涤，而且需要透析袋，并且不能回收大片段DNA;低熔点琼脂糖法试剂较昂贵，须抽提DNA，而且回收率较低。本研究利用固相中高浓度的DNA可向低浓度溶液中转移的原理，将含拟回收DNA片段的凝胶块置入双蒸水中，捣碎、浸泡后，直接取液相进行PCR反应，方法简单、快速，不需DNA的抽提和纯化，扩增阳性条带清晰，背景干净，表明直接回收法所获取的DNA不仅在量上，而且在纯度上均可满足PCR扩增的模板要求。该法同样适用于从聚丙酰胺凝胶中回收DNA片段，有推广应用价值。
参考文献
1 姜宏，李麓芸，卢光.小鼠生精细胞凋亡相关基因的分子克隆.生物化学与生物物理学报，2001，33（4）:421-425.
2 姜泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法，北京:人民军医出版社，1996，3-4.
