目的
带有特定基因的质体在分子生物研究上，是一个很重要的工具，将质体送入细菌的过程称为基因转形，经由基因转型可使质体在细菌中大量复制，以备进一步研究。本实验将把你在前面转殖实验中cDNA和质体DNA的连结反应送入细菌。 你将从本实验学习如何进行基因转型作用。
原理
早在1970年左右，有人发现细菌经由冰冷的CaCl2处理后，可以转染(transfect)噬菌体凹后来发现同样的方法可以用来转型质体及大肠杆菌染色体DNA。可见经由CaCl2处理后的大肠杆菌胜任细胞(competent cell)，具有纳入DNA的能力，虽然机制仍然不清楚，但是此方法却在实验室中被广泛使用。本实验是先将大肠杆菌以CaCl2处理成胜任细胞，再加入带有抗ampicillin基因的质体，以使其纳入大肠杆菌中。 42 oC 的热休克作用有助于提高基因转型作用的效率，再经由一段恢复期后，就可以生长在含ampicillin的培养基上以便筛选。此方法的转型效率为每g的supercoiled DNA可产生5x106至2x107个转型菌株。
材料
• E. coli strain DH5
• LB培养液：每公升含10 g tryptone，5 g yeast extract，5 g NaCl
• LB固体培养基：配方如LB培养液，加上15 g agar，高压灭菌后让其冷却至约50 oC，视需要加入抗生素、IPTG、X-Gal等，立即倒入培养皿内，待其固化。
• 50 mM CaCl2溶液
• 100 mg/ml ampicillin
操作步骤
1. 将作为宿主(host)的大肠杆菌DH5，于2 ml LB培养液中做隔夜培养。
2. 第二天，取0.2 ml的饱和菌液加入10 ml LB培养液，于37 oC 200 rpm摇晃培养至菌液的OD600为0.4，约1小时。
3. 将菌液倒入15 ml离心管中，在2,500 g下离心5分钟，倒掉上清液。 菌液沈淀则以5 ml冰过的50 mM CaCl2溶液回溶，并静置冰上30分钟。 经由CaCl2处理过的细菌变得较脆弱，故以下操作勿太激烈且在冰上进行。
4. 再度在2,500 g下离心5分钟，倒掉上清液。 菌液沈淀则以0.5 ml冰过的50 mM CaCl2溶液小心回溶，此时已完成胜任细胞的制备。
5. 取适量的质体DNA与200 l的胜任细胞混合后，置于冰上30分钟。期间每5-10分钟拍打混合物一次，以防止菌液沈淀。
6. 放入42 oC水浴2分钟热休克处理后，立即放回冰上。
7. 加入1 ml LB培养液，于37 oC 200 rpm摇晃培养1小时进行恢复。
8. 取已完成基因转型作用的菌液，以推棒均匀涂抹于含100 g/ml ampicillin, 0.5 mM IPTG, 40 g/ml X-Gal的LB固体培养基上，每个培养基含10 l至400 l 的菌液，做隔夜培养。长出的单一菌株，可用于进一步的筛选。
结果及讨论
1. 计算培养基上菌落的数目。 请说明你如何从转型效率来判断所制备之胜任细胞是否成功。
2. 你所得之菌落中，蓝色及白色的比例为何？ 请解释它的意义。
3. 其它你认为值得讨论之发现。
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质体DNA的少量制备和限制脢切割分析
目的
带有特定基因的质体在分子生物研究上，是一个很重要的工具，因而必需先将质体自细菌中抽出，以备进一步研究。本实验将从你在前面转型实验所得到的细菌中，抽取质体DNA，再进行限制脢切割分析，以确定DNA的选殖成功。你将从本实验中学习如何自细菌中少量制备(mini-preps)质体DNA及进行限制脢切割分析。
原理
本实验所采用之质体DNA少量制备的方法为碱溶解法(alkaline lysis method)。以含有SDS及NaOH的溶液将细菌溶解，SDS会使蛋白质变性，而NaOH则使染色体及质体DNA变性。环形质体DNA因拓朴缠绕之故，其两股DNA并不会游离，当以酸性之potassium acetate溶液去中和反应时会很快地再度黏合。同时，potassium acetate也会使染色体DNA、大分子RNA、蛋白质及SDS均形成沉淀，而能以离心去除。 Phenol/chloroform则可进一步萃取掉残存的蛋白质。 质体DNA则以酒精沉淀加以浓缩。如此得到之少量制备的质体DNA可以限制脢切割，再于琼胶电泳分析分子量以确认之。通常，一些high-copy-number的质体，如pUC，每ml的饱和菌液可以抽得3-5 g的DNA分子。
材料
• LB培养液：每公升含10 g tryptone，5 g yeast extract，5 g NaCl
• 100 mg/ml ampicillin
• NaOH/SDS solution：0.2 N NaOH，1% sodium dodecyl sulfate
• Potassium acetate solution：溶解29.6 g potassium acetate于约80 ml的蒸馏水中，以glacial acetic acid调至pH 4.8 (约需11.5 ml)，再加水至总体积为100 ml。
• Phenol/chloroform 1:1
• 95%, 70% ethanol
• 10X EcoRI buffer：500 mM NaCl，1M Tris-HCl (pH 7.5)，100 mM MgCl2，0.25% Triton X-100
• 10 mg/ml RNase A
• EcoRI：20 units/l，购自New England BioLabs公司
• 10X loading buffer：20% Ficoll 400，0.25% Bromophenol blue，0.25% Xylene cyanol
• 2% agarose gel：称取2 g agarose，加入100 ml的1X TAE buffer，以微波炉煮沸至溶解，待其冷却至约60℃后倒入胶体形成盒内。将齿梳插上，静置30-50分钟。 小心将齿梳取下，放入电泳槽内，加入1X TAE buffer使之淹过胶体。
• 50X TAE electrophoresis buffer：每liter含有242 g Tris base，57.1 ml glacial acetic acid，100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)
操作步骤
(一)质体DNA的少量制备：
1. 从实验五之培养基上挑取白色菌株，种于含有100 g/ml ampicillin的LB培养液中，做隔夜培养。
2. 第二天，取1.5 ml饱和菌液放入微量离心管中，以12,000 rpm离心30秒，倒掉上清液，并以微量吸管吸掉残留的菌液。
3. 加入100 l的TE，剧烈震荡30秒以将菌液沈淀完全回溶。
4. 加入200 l NaOH/SDS solution，上下颠倒摇动多次以充分混和。置于冰上5分钟。 此时因细菌溶解，菌液会由混浊变澄清而稍黏。
5. 加入150 l potassium acetate solution，上下颠倒摇动多次混和均匀后，会产生白色悬浮颗粒。
6. 于12,000 rpm离心5分钟后，用牙签挑掉白色沈淀。
7. 加入等体积(约400 l) phenol/cholroform 1:1，剧烈震荡30秒。 于12,000 rpm离心1分钟后，以微量吸管小心吸取上层水层至另一微量离心管中，切勿取到界面的白色蛋白质沉淀。
8. 加入2.5倍体积之95% ethanol，置于室温2分钟以沈淀DNA。
9. 于12,000 rpm离心10分钟后，小心倒掉上清液，留下底部少量的DNA白色沈淀。
10. 加入1 ml 70% ethanol，上下颠倒摇动多次以清洗。
11. 以12,000 rpm离心3分钟后，小心倒掉上清液，留下底部少量的DNA白色沈淀。并在干净卫生纸上尽可能吸掉残留的酒精。
12. 真空抽干后，最后加入20 l TE，以微量吸管吸冲多次，以使DNA白色沈淀完全回溶。
(二)限制脢切割分析：
1. 于微量离心管中加入以下物质，并完成混合：
蒸馏水 2 l
10X EcoRI buffer 1 l
RNase A (0.2 mg/ml) 1 l
少量制备之质体DNA 5 l
EcoRI (10 units/l) 1 l
2. 置于37 oC水浴，2小时。
3. 加入1 l 10X loading buffer，混合后加载2%琼胶，进行电泳。
4. 电泳后，将琼胶置于紫外光箱上观察，以确定是否选殖出建构完成之质体。
结果及讨论
1. 请估计你少量制备之质体DNA的总量。
2. 说明你的限制脢切割分析结果，并解释如何判断你已选殖到所欲建构之质体DNA。
3. 其它你认为值得讨论之发现。
