福建省人民医院检验科(350004) 孙凤皋 许少锋 林 青 福建医药杂志
摘要 目的 评价国产的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)直接测定法在临床上应用的可行性。方法 将国产的直接测定法与硫酸葡聚糖镁(DS-mg2＋)沉淀法进行比较分析，观察其精密度，线性范围，准确度及部分干扰因素。结果 直接测定法的CV略小于DS-mg2＋法，与DS-mg2＋的相关性良好，＝0.83x＋0.26，r＝0.92，HDL-C含量在2.30mmol／L时线性良好；黄疸、溶血对直接测定法有一定的影响，对非HDL-C脂蛋白的遮蔽能力优于DS-mg2＋法。结论 国产的HDL-C直接测定法试剂，各项方法学指标不差于DS-mg2＋法，且快速简便适于自动化分析仪。
关键词 高密度脂蛋白胆固醇 直接测定法 国产试剂
高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定作为脂类代谢的检测指标已广泛应用于心脑血管疾病的流行病学研究及相关的临床诊治。HDL-C含量与动脉粥样硬化呈负相关已得到公认，并作为脂类代谢异常的危险因素指标之一。近年来，国外已有HDL-C直接测定的方法，国内也见到有关进口试剂应用的报道及方法学评价［1］。然而，进口试剂价格昂贵，难适应我国国情。1998年底，国内试剂厂家首先推出国产的HDL-C直接测定法的试剂，其价格明显低于进口试剂，该试剂的测定原理是聚阴离子在表面活性剂的作用下，选择性地与血清中脂蛋白结合，对HDL-C以外的脂蛋白遮蔽，最后HDL-C与显色剂反应(下称一步法)。我们就该试剂的方法学及影响因素作系统的评价并与DS-mg2＋法［2］进行比较，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 样本：
1.1.1 测试用的标本：选用本院住院或门诊病人的样品，早晨空腹取血，自行凝固后离心分离血清，当天或1周内完成(标本－20℃保存)。
1.1.2 混合血清：取无黄疸、无脂血、无溶血的血清若干份混合，离心后留用。
1.1.3 健康组：选用体检无心脑血管疾病及与脂类代谢异常无关疾病的健康者50例，年龄为23～77岁。其甘油三酯(TG)的浓度范围在0.4～1.80mmol／L，胆固醇(CHOL)的浓度范围为2.3～5.7mmol／L，APOAⅠ范围在1～1.6g／L，APO-B的范围内为0.6～1.10g／L。
1.2 试剂：DS-mg2＋法试剂盒选用美国Beckman公司原装试剂盒(批号为802139)；一步法试剂选用浙江温州东欧生物工程有限公司提供的HDL-C直接法(批号为9913018)，该试剂由样本前处理液RⅠ及酶试剂RⅡ组成；CHOL、TG试剂均由Beckman公司提供，Apo-AⅠ、Apo-B试剂由东欧生物工程有限公司提供；所用的标准品均由相对应试剂公司提供。其中HDL-C直接测定法的标准品，批号为9906023，浓度为1.25mmol／L。
1.3 仪器：所有的血脂及HDL-C测定均在美国Beckman CX5 date自动分析仪上进行。
1.4 方法：CHOL、TG为酶法测定；Apo-AⅠ，Apo-B为免疫比浊法(终点)；HDL-C沉淀法按Beckman试剂盒说明书操作；HDL-C一步法，按说明书操作，血清3μl加RⅠ试剂300μl，37℃反应5分钟，再加入RⅡ试剂100μl，37℃反应5分钟，主波长520nm，次波长600nm，用吸光度差值进行运算。
2 结果
2.1 精密度试验：我们选用三无的混合血清进行批内及批间的变异测定，结果见表1。
表1 两种方法的批内、批间变异
方法 均值mmol／L s n CV(%)
DS-mg法批内 1.477 0.040 23 2.68
DS-mg法批间 1.431 0.077 30 5.38
一步法批内 0.954 0.022 29 2.31
1.700 0.045 19 2.64
一步法批间 1.293 0.638 23 4.93
2.2 线性分析：我们将一浓度为2.59mmol／L的HDL-C血清标本，用生理盐水作梯度稀释，使之含血清1／5、2／5、3／5、4／5、8／9及原倍。分别用两种方法进行测定，DS-mg2＋法的线性达2.59mmol／L，一步法的线性达2.30mmol／L。
2.3 一步法的灵敏度：我们对一步法连继测定20次的试剂空白，求其均值以3S为检出的最低下限，如果为0.087mmol／L。
2.4 对比试验：我们选用50份血清标本，用两种方法同时进行测定，所得结果经统计学分析，t＝1.275，P＞0.05，无显著性差异，且相关性良好，见表2。
表2 一步法DS-Mg2＋法的相关性
方法 HDL
(mmol／L ±s) 直线回
归方程 相关
系数 偏差(%)
DS-Mg2＋（x） 1.45±0.40
一步法(y) 1.46±0.328 ＝0.83x＋0.26 0.92 ＋1.0
2.5 健康对照组：选用体检健康的空腹标本26例进行测定，DS-mg2＋法的结果为1.20±0.42mmol／L（±s)，一步法的结果为1.29±0.38mmol／L（±s)。经统计学处理，两者差异无显著性(P＞0.05)。
2.6 干扰试验：在一份HDL-C正常的血清中(三无)分别加入不同浓度的胆红素及血红蛋白溶液，用一步法进行测定。实验结果显示，当胆红素浓度达61mmol／L时，对一步法测定HDL-C有正干扰。血红蛋白浓度在1g／L以下(含1g／L)对反应有轻微的负干扰，当浓度在5g／L以上时，对反应存在显明的正干扰。
2.7 对高脂的处理能力：我们以甘油三酯的含量来衡量血清中血脂的水平，取一分TG浓度为25mmol／L的样本，进行较密的梯度稀释后进行测定。结果显示，当血清TG浓度为5mmol／L以下时，一步法测定HDL-C线性良好；而DS-mg2＋法只能在TG浓度为4mmol／L以下的样本可被完全沉淀。
3 讨论
HDL-C一步法的问世无疑是HDL-C测定方法的革新，国产HDL-C一步法试剂的开始给这一革新的技术推广带来很大的优势。本文结果显示，一步法的结果与国际上推荐的DS-mg2＋法相比较，相关性良好，差别无显著性意义，平均变异系数为3.3%，与DS-mg2＋的偏差为＋1％。达到美国国家胆固醇教育计划(NCRP)1998年HDL-C的分析目标［3］。其精密度及线性范围。也能达到临床要求。
当样本中胆红质浓度低于61μmol／L时对一步法测定HDL-C无影响；血红蛋白浓度超过5g／L时，对HDL-C一步法测定有明显的正干扰。试验中我们发现血红蛋白(Hb)浓度对HDL-C测定有双向干扰作用，对低值Hb呈负干扰；高值Hb呈正干扰，这可能是因为轻度溶血时，红细胞释放的过氧化物酶分解了胆固醇反应中产生的H2O2，使反应产物醌类物质减少；当溶血严重时，Hb在使520nm处的吸光度值增加，故呈正干扰现象。TG浓度在5.0mmol／L时，不影响一步法测定HDL-C的结果，而DS-Mg2＋法在此TG浓度时，就不能完全沉淀样本中的非HDL-C脂蛋白。
HDL-C测定值对心脑血管及脂类代谢异常疾病的应用不同于其他脂类检测指标，因为它与疾病的危险程度呈负相关，即在HDL-C范围的下限，极小的试验误差，可能造成相对较大的影响，且HDL-C的结果，直接影响LDL-C的计算值。采用一步法，测定HDL-C简化了操作程序，减少了造成误差的环节，且能直接在自动化分析仪上检测。应用分析仪测定，由于采用双、多波长，双试剂进行分析，可在一定程度上排除了样本中一些未知干扰物质的影响，从而提高了HDL-C测定的精密度，为HDL-C测定的准确性提供了必要的条件。
在预试验中我们发现，一步法在测定过程中加入RⅡ试剂，37℃5分钟，反应即完成，并可稳定10分钟。但超过10分钟，结果会随时间的延长而增高，推测R1试剂所遮蔽的脂蛋白在一定时间后可能存在解离现象，此有待进一步证实。
国产的HDL-C一步法具有精密度好，与国际上推荐的DS-mg2＋法的偏差仅为＋1％，线性范围广、样本用量少，适用于各种自动化分析仪检测且价廉等优点，所得结果符合NCEP规定的要求，东欧生物工程公司的HDL-C直测法试剂可用于临床。
参 考 文 献
1.李清华，等.对高密度脂蛋白胆固醇直接测定法的评价.临床检验杂志.1998，16∶269.
2.Warnick GR，et al．Dextran Sulfate-mg2＋ Precipitation Procedure for guantitation of high density eipoprotein cholesterol proposed selected method.Chin Chem．1982，28∶1379.
3.Warnjck GR，Wood PD．National cholesterol education program recommendations for measurement of high-dinsity lipopotein diolesterol executive summary．Clin Chem，1995，41∶1427～1433．
