蒋天舒，周晔，陈燕，陈波，谷明莉，邓安梅，仲人前
【摘要】目的探讨发作性睡病与HLA-DRB1基因的相关性。方法30例患者经系统的病史询问、查体、多次小睡潜伏时间试验测试（MSLT）等方法诊断为发作性睡病。用序列特异性引物-聚合酶链反应（PCR-SSP）分型技术，对30例发作性睡病患者和44例健康人进行HLA-DRB1等位基因的检测。结果发作性睡病患者组DRB1*15出现频率为53.33%，与正常对照组13.64%相比较明显增高，经统计学分析差异有显著性（P＜0.05）。结论HLA-DRB1*15基因为中国发作性睡病人群的易感基因。
【关键词】发作性睡病；HLA基因；易感性
Study on the association between HLA-DRB1*15 genes and narcolepsy
JIANG Tian-shu，ZHOU Ye，CHEN Yan，et al.Laboratory Diagnostics，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，and Clinical Immunology Center of PLA，Shanghai 200003，China
【Abstract】ObjectiveTo investigate the association between HLA-DRB1 genes and narcolepsy.MethodsHLA typing were performed in 30 patients with narcolepsy by HLA-DRB1 resolution PCR-SSP（sequence specific primers），then the frequencies of alleles were analyzed compared with normal controls.ResultsThe frequencies of DRB1*15 in narcolepsy were significantly higher than normal controls（53.33% versus 13.64%）.ConclusionDRB1*15 was susceptible gene for narcolepsy.
【Key words】narcolepsy；HLA gene；susceptibility
发作性睡病（narcolepsy）是一种病因不明的慢性神经系统疾病，常于青春期前起病，并持续终生。典型特征性睡眠性疾病患者具有白天过度睡眠、夜间睡眠不安以及病理性快速眼动睡眠（REM）的临床表现，还可并发猝倒、睡眠幻觉、耳鸣、忧虑、焦虑、记忆力减退等症状［1］。近年来国外已有关于发作性睡病与HLA抗原基因相关性的研究报道［2，3］。笔者用聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）方法对HLA-DRB1等位基因进行检测，对它们在特异性发作性睡病及正常人的分布进行比较，以了解它们与特异性发作性睡病遗传易感性的关系。
1资料与方法
1.1研究对象特异性发作性睡病组：中国汉族患者30例，均符合发作性睡病诊断标准。其中男24例，女6例；年龄9～40岁，平均18岁。对照组：为与患者同地区的、与患者无血缘关系的、无特异性发作性睡病发病史的健康人群，共44例。
1.2实验材料
1.2.1主要试剂Taq DNA 聚合酶（Promega 公司）、Qiagmp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN公司）、HLA-DRB1基因分型试剂盒（ONE-LAMBDA公司）。
1.2.2主要仪器PCR自动扩增仪（GeneAmp 9600，PE，USA）、微量凝胶电泳系统（Abgeme，英国）、紫外分光分析系统（MultiImageTM，Aipha Innotech Corporation）。
1.3诊断标准参照睡眠障碍国际分类（ICSD）［4，5］，并结合发作性睡病的临床特征：（1）患者有白天过度嗜睡或突然肌无力主述。（2）每天有频繁小睡或突然进入睡眠状态。（3）多导睡眠图（polisomnography，PSG）记录：睡眠潜伏期小于10min；REM睡眠潜伏期小于20min；多次小睡时间MSLT中平均睡眠潜伏期小于5min；两次以上睡眠开始时REM发作。
1.4实验方法
1.4.1基因组DNA的制备应用DNA提取试剂盒抽提外周血白细胞中的DNA。取2μl的DNA样品，用紫外分光光度法检测样品的A值及纯度，最后DNA调准为100μg/ml。
1.4.2实验方法应用PCR-SSP（polymerase chain reaction/sequence primers）方法检测HLA-DRB1位点的基因型。将含有DNA、Taq DNA 聚合酶、PCR-Mix的混合液以每孔10μl的量加入HLA-DRB1基因分型板的24个含特异性引物的小孔；以每孔12μl的量加入HLA-DRB1基因分型板的32个含特异性引物的小孔。PCR扩增条件为96℃预变性130s，63℃退火和延伸60s，1个循环；96℃变性10s，63℃退火和延伸60s，9个循环；96℃变性10s，59℃退火50s，72℃延伸30s，20个循环。
1.4.3基因型的确定以2%的琼脂糖凝胶电泳，90V稳压15min。紫外灯下观察，根据PCR产物的有无及分子量大小对照HLA-DRB1基因分型格局表确定基因型别。
1.4.4统计学处理用直接计数法计算基因频率。两组间基因频率的比较采用χ2检验。P值均用Bonferron法进行校正P值（Pc），Pc<0.05为差异有显著性。
2结果
2.1发作性睡病组HLA-DRB1基因频率的分布作DRB1基因的DNA分型，共检出13种基因型。患者组DRB1*15基因频率（53.33%）较正常对照组（13.64%）明显增高，经统计学分析差异有显著性（χ2=26.91，P＜0.05）。见表1。表1HLA-DRB1基因在发作性睡病与正常对照组中的分布
3讨论
HLA II 类分子在自身反应性T细胞的成熟中以及T细胞活化和免疫识别中起重要作用。HLA具有高度多态性，不同的HLA分子因结构上的差别，特别是抗原结合部位上某些氨基酸残基的不同，在一定程度上决定了HLA分子对自身抗原的亲和力，从而直接影响它们递呈抗原肽并激活特异性T细胞的能力。HLA II 类抗原分子多态性的氨基酸序列主要存在于分子外侧功能区的3个超变区中，这种多态性决定了不同HLA II 类分子与抗原结合部位即裂隙的细微差别，并此影响与抗原肽的结合。在HLA分子、抗原肽及T细胞受体三分子复合物的相互作用中，因为某些原因机体不能区分自我和非我，导致自身免疫反应的发生。据此推测，可能是这一类将自身抗原递呈给抗原特异性T细胞的特殊HLA分子携带着发作性睡病的遗传易感性，且可影响病情进展。
本研究采用PCR-SSP方法对HLA-DRB1等位基因进行了检测，结果发现HLA-DRB1*15在发作性睡病及正常对照组中的基因频率分别为53.33%和13.64%；经统计学分析差异有显著性 （χ2=7.168，P＜ 0.05）。此结果进一步证实了HLA-DRB1*15为发作性睡病的易感基因，这与其他学者的研究一致［6～9］。不同的HLAII类基因产物参与提呈不同的抗原肽，并诱发出特异性和强度不同的免疫应答。HLA-DRB1*15可能在免疫应答过程中起重要的调控作用，使T细胞激活，导致免疫反应增强，参与发作性睡病病变的形成。
发作性睡病在国人中的患病率只有0.04%左右［10，11］。本研究亦显示，中国发作性睡病患者与DRB1*15存在一定的相关性，但要对发作性睡病患者做进一步的诊断、治疗，尚需更深层次的探索。
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作者单位： 200003 上海，第二军医大学长征医院实验诊断科，全军临床免疫中心
