［关键词］ DNA序列分析; 基因变异; HBVM DNA定量
Affection of Gene Mutation to Serological Markers
and Quantity of DNA of Hepatitis B Virus
XI Huaxin, JIANG Yueming
(1.The Blood Center of Wuxi,Wuxi Jiangsu 214021; 2.Wuxi Hospital for Infectious Disease,Wuxi Jiangsu 214007, China)
［Abstract］ Objective: To report HBV preC／Cgene mutation in wuxi area,to determine the affection of gene mutation to serological markers and quantity of DNA hepatitis B virus.Methods： Serological markers of hepatitis B virus were detected by timeresolved fluorescence immunoassay. Quantitative analysis of HBV DNA PCR was performed by Roche Lightcycler fluoresencent quantitative amplification analyzer which made in Germany. HBV DNA preC／Cgene fragments were directly sequenced by Roche MagNA Pure LC automatic nucleic acid getting, sampling system made in Germany and Beckman CoulteCEQ8000Genetic Analysis System made in the U.S. Results： Fortyone from nintytwo(41／92)patients had preC／Cgene mutation at site at nt1896.there thirtyfour HBeAg were negative and seven HBeAg were positive.Gene mutation at site at nt1896 didn’t affect virus replication. Conclusion： How HBeAg getting negative was dependant on nt1896 site gene mutation.Gene mutation at site at nt1896 didn’t affect hepatitis B virus replication.
［Key words］ DNAgene fragments analysis;Gene mutation;Serological markers of hepatitis B virus;Quantitative analysis of HBV DNA
HBV感染在临床可产生不同的肝脏疾病谱,过去多以HBV免疫学标志物来判断病毒感染状况［1］。但随着分子生物学技术的发展,研究发现肝脏疾病谱不仅与宿主的免疫有关,也与病毒本身密切相关,即HBV 本身也存在变异。对HBV变异的判断,最可靠和精确的方法是从病人体内检出HBV DNA,用DNA测序法来确定病毒的变异,目前对于HBV的变异的研究比较集中在关于前C区及S基因区的变异。本文结合92例乙肝患者的PCR定量、免疫学标志物定量结果以及DNA前C／C区测序结果报道如下。
1 材料与方法
11 分析对象
本组92例为无锡地区2004年1月~10月在无锡市传染病医院门诊及住院的乙肝患者,均为HBVDNA阳性病人。
12 检测方法
121 乙肝病毒标志HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗Hbe和抗HBc以美国PE1235automatic immunoassay system 检测,试剂为上海新波产的两对半时间分辨荧光定量试剂。
122 定量聚合酶联反应(PCR)HBV DNA定量PCR 以德国Roche Lightcycler荧光定量扩增仪检测,试剂为深圳匹基产HBV DNA荧光定量试剂。
123 HBV DNA前C／C区测序 使用① 德国Roche MagNA Pure LC全自动核酸提取、加样系统,获得HBV DNA模板;② 在美国PE9600扩增仪扩增:94℃预变性3 min,94℃ 30 s,50℃ 30 s,72℃ 30 s,循环35次;③ 用Promega公司的PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物;④ 纯化产物用Beckman测序试剂盒进行测序反应:96℃ 20 s,55℃ 20 s,60℃4 min,循环30次,终止测序反应,然后在美国Beckman Coulter CEQ8000 Genetic Analysis System上得到HBV DNA 的序列和图谱。所测HBV DNA序列的碱基位置:nt17372483,所测长度:746 bp,上游引物序列及位置:5’GAGTTGGGGGAGATTAG3’(17371756),下游引物序列及位置:5’AAAGTTTCCCACCTTATGAGTC3’(24832462);引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。
124 统计学处理 采用t检验和χ2检验。
2 结 果
21序列结果
序列结果见表1。表1 主要前C／C区基因变异位置与意义
22 1896位图谱
1896位正常图谱见图1,突变图谱见图2。
23 HBVM与1896位变异
HBVM与1896位变异结果比较见表2。
24 1896位变异与e抗原相关性
1896位变异与e抗原相关性见表3,经过χ2检验P<0005,e抗原的表达与1896位变异密切相关,也就说明e抗原转阴主要是由1896位变异引起的。
25 变异与病毒复制
以nt1896变异分组,两组病毒DNA定量见表4,差异无显著性(P>005)。说明该变异不影响病毒复制。
3 讨 论
表1中HBV DNA 1827位ntc→a突变达88％, 表2 HBVM与1896位变异表3 1896位变异与e抗原相关性表4 病毒与DNA定量相关性基本体现无锡地区HBV DNA单核苷酸多态性突变水平,意义目前不详。1896位ntg→a突变达446％(41／92),据国外报道,这种变异大多发生在亚洲东部及南欧地区,发生率可以高达47％～60％,而在美国只有10％左右,胡耀仁等［2］报道宁波乙肝患者1896位变异率为4258％,本文结果与报道相近。由于1896位ntc→a突变(鸟嘌呤→腺嘌呤),使原来编码色氨酸的前C区第28个密码子(TGG)转变为翻译终止密码子(TAG),因而前C蛋白的翻译中断,HBeAg不能产生,检测会出现阴性结果,从表3中可见,与变异有关HBeAg转阴有34例,从而证实1896位变异与HBeAg转阴具有密切相关性。2005位ntt→a突变和2074位ntt→c突变因为是密码子的第三碱基发生突变,翻译的氨基酸仍是原来的氨基酸,属同义突变。
图谱分析是测序仪利用4种荧光染料分别标记终止物ddNTP,通过电泳将各个荧光标记片段分开,经激光扫描,光栅分光,区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,在 CCD摄影机上同步成像。图1显示1896位正常为G,图2显示1896位发生突变为A。
从表3可以看出(由表2中统计而来),1896位变异组共有41例,其中34例e抗原阴性,说明与1896位变异有密切关系(P<0005);有7例e抗原仍为阳性,可能与体内仍存在野生株复制的情况有关。在51例1896位未变异一组,其中13例e抗原阴性,而HBV DNA定量显示有病毒的复制,与理论结果不符,原因可能与其他位点变异有关。
从表4中可以看出以nt1896位变异分组,两组病毒DNA定量无显著性差异(P>005),说明1896位变异会导致HBeAg不能产生,检查阴性结果,但不能反映HBV复制减轻和消失,而仍有HBV前C区变异病毒的存在和复制,结论与文献相符［3］。
李伯安等［4］认为单独的血清学标志检测不能反映肝脏的病变程度,也不能良好反映病毒的复制。
临床上对不同肝脏疾病谱的认识,有必要结合二对半结果和PCR DNA定量以及基因测序结果,才会对乙肝病毒的感染状况有一个比较准确的判断,才能对症治疗,取得较好的治疗效果。由于前C／C区1896位的变异,导致HBeAg转阴,不能就此而否定病毒的复制。
测序结果表明,HBV病毒基因变异对HBVM结果产生根本性的影响,它们是基因型和表现型的关系,即基因型决定表现型,但病毒复制继续进行。
［参考文献］
［1］ 许化溪.病原生物学检验：理论与临床［M］.北京:人民卫生出版社,2003:243-244.
［2］ 胡耀仁,唐锡尔,应 豪,等.乙型肝炎患者HBV前C区变异及临床意义［J］.宁波医学,1999,11(3):103-104.
［3］ 曹 利,张汉荣,孙 梅,等.乙型肝炎病毒C基因启动和前C终止变异与乙型肝炎标志物模式的关系及临床意义［J］.临床荟萃,2005,20(2):61-63.
［4］ 李伯安,戚 扬,刘 岩,等.慢性乙型肝炎血清学标志HBV DNA定量分析及HBV前C／C变异的临床研究［J］.军事医学科学院院刊,2004,28(2):152-154.
( 1.无锡市中心血站检验科， 江苏 无锡 214021；
2.无锡市传染病医院检验科， 江苏 无锡 214007
