邱春嫦 ，劳小斌
摘要:目的 了解电化学发光法（ECL）检测乙肝病毒标志物的应用价值。 方法 用ELISA法和ECL法平行测定360例疑似乙肝病人血清乙肝五项标志物，并对ELISA法检测为阴性而ECL法检测为低浓度HBsAg的标本，再用微粒子酶免分析法（MEIA）进行复测并分析。 结果 ELISA法和ECL法对HBsAb、HBeAg、HBeAb三项标志物的检出率无显著性差异，但对HBsAg的检测，ECL检出率明显高于ELISA法（P<0.05）。ELISA检测为阴性而ECL法检测为低浓度HBsAg的标本，用MEIA法复测均为阳性。 结论 ECL法检测血清乙肝标志物的灵敏度和自动化程度均比ELISA法高，同时可动态观察疗效和监测病情。
关键词:电化学免疫分析法;乙肝标志物;临床应用
Clinical application of hepatitis B virus attribute detected by electrical chemiluminescence immunoassay（ELC）.
QIU Chun-chang，LAO Xiao-bin.
（Laboratory Department of First Affiliated Hospital of Jinan University，Guangzhou510630，Guang-dong，P.R.China）
Abstract:Objective To understand the theory，the advantage and the clinic application of HBV determined by electrical chemiluminescence immunoassay（ECL）. Methods Five types of HBV in the serum of360cases have been determined directly by ELISA and ECL，the samples which are negative determined by ELISA however are positive with low concentration of HBsAg should be determined again by MEIA method.At last the results determined by ELISA and ECL are processed by one-to-oneχ 2 test with SPSS10.0statistics software. Results The result is that the rate of detection of HBsAb，HBeAg and HBeAb are have no distinct difference determined directly by ELISA and ECL.but the rate of detection of HBsAg determined by ECL is higher than that deter-mined by ELISA（P<0.05），and the rate of detection of HBcAb is have distinct difference（P<0.01）.The results determined a-gain by MEIA are all positive of HBsAg. Conclusion The degree of sensitive and automation determined by ECL are higher than that of ELISA，at the same time the curative effect of patients is be easily dynamic observed and the state of illness is also be easily in-spected by the method of ECL.
Key words:Electrical chemiluminescence immunoassay analysis method;Hepatitis B virus attribute;Clinic application
中国是乙型病毒性肝炎的高发国家，根据流行病学调查，人群发生率较高，表面抗原携带率约为15% ［1］ ，乙肝的实验诊断对于治疗及预防有重要参考意义.但现常规使用的ELISA法，对低浓度HBsAg标本前后结果常不一致，严重影响了临床的可比性.因此为提高乙肝实验诊断方法的灵敏度、精确度和减少劳动强度，现试以电化学发光免疫分析法（ECL）进行检测，并与ELISA平行比较分析评价。
1 材料和方法
1.1 材料及主要仪器 收集360例疑似乙肝病人静脉血样离心，分离出血清待测;ELISA法测定乙肝“两对半”试剂盒由上海实业科华生物技术有限公司生产，使用美国Bio-rad680型酶标仪和1575型洗板机;ECL法仪器和试剂采用德国罗氏公司生产的Elec-sys2010电化学发光免疫分析仪和其配套试剂产品;微粒子酶免法（MEIA）仪器和试剂采用美国雅培全自动酶免分析仪AxSYM及其配套试剂产品;乙肝五项标志物的定值参比血清由国家卫生部临床检验中心提供。
1.2 方法
1.2.1 电化学发光法（ECL）（以双抗体夹心法为例）其原理为化学发光剂三联吡啶钌［Ru（bpy）3］ 2+ 和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。二价［Ru（bpy）3］ 2+ 被氧化成三价强氧化剂。TPA失去电子后被氧化成阳离子自由基TPA + ，其不稳定，可自发地失去一个质子（H+），形成自由基TPA，变为强还原剂，可将一个电子递给三价的［Ru（bpy）3］ 3+ 使其形成激发态的［Ru（bpy）3］ 2+ 。激发态的三联吡啶钌不稳定，很快发射出一个波长620nm的光子，回复成基态的三联吡啶钌。这过程可以在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使信号增强.将待测样本与包被的顺磁性微粒和发光剂标记的抗体加在反应杯中共同温育，形成磁性微珠包被抗体-抗原-反光剂标记抗体复合物。将复合物吸入流动室，同时用TPA缓冲液冲洗。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的磁铁吸引住，而游离的发光剂标记抗体被冲走。同时在电极加电压，启动ECL反应，使［Ru（bpy）3］ 2+ 和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光。光的强度与待测抗原的浓度成正比 ［2］ 。
1.2.2 采用ELISA法 ［3］ 和ECL法 ［2，4］ 检测收集的血清标本的乙肝五项标志物，每次以定值参比血清作为质控。对ELISA检测为阴性而ECL法检测出为低浓度HBsAg的标本用MEIA法进行复测。具体操作均按其仪器和试剂盒说明书进行。
1.2.3 使用SPSS10.0统计学软件对ELISA和ECL两种方法检测结果进行配对χ 2 检验。
2 结果
2.1 ELISA与ECL法检测乙肝标志物的结果见表1。表1 ELISA法检测乙肝标志物的结果在ECL法的表现（略）注:※P<0.05;※※P<0.01
2.2 用MEIA法对ELISA检测为阴性而ECL法检测出为低浓度HBsAg的9例标本，占进行中和确证试验，中和率均>50%，确定HBsAg结果均为阳性。
2.3 卫生部定值血清HBsAg项室内质控CV值:ELISA法批内3%～5%，批间5%～10%，而ECL法批内小于3%，批间小于5%。
3 讨论
3.1 ELISA与ECL法检测乙肝五项指标的结果中，HBsAb、HBeAg、HBeAb三项标志物的检出率无显著性差异，但HBsAg的检出率高于ELISA法（P<0.05），而HBcAb的检出率则有显著性差异（P<0.01）。从方法学角度看Elecsys系统使用固相载体为顺磁性微粒，直径2.8μm，由于颗粒体积小，比相同体积塑料珠的表面积大，因此扩大了反应面积，同时由于标志物的循环利用，使发光时间延长，强度增加，大大提高了检测灵敏度 ［2］ ，所以可检出人群中低浓度的表面抗原（小于1μg·L -1 ）和自然感染获得的乙肝核心抗体。
3.2 Elecsys全自动免疫分析仪通过仪器所带计算机编程制实现加样分析、报告、质控和故障检出等过程的自动化，且顺磁性微粒在磁场中紧贴在电极上，易进行结合相和游离相的分离和洗涤，同时由于使用配套试剂使人为因素减至最低，提高了方法的稳定性和结果的重复性，减少了污染机会。而手工ELISA法由于手工加样，孵育时间的控制，洗板等因素影响则容易造成低浓度的乙肝标志物结果不稳定。
3.3 ECL法对乙肝血清标志物的定量检测，灵敏度高，HBsAg可测至0.05μg·L -1 ，故对急性乙肝能及早检出HBsAg，确证乙肝病毒感染，在病程观察中大大缩短“窗口期”时间。另外，电化学发光法定量检测，克服了定性对灰区结果的判断困难，对灰区结果能做出明确客观的评价和判断，能为医生对病情疗效做出合理的解释，并且指导治疗，更有利于医患沟通。
3.4 在乙肝表面抗体的检测上，ECL法为定量结果，能够对机体是否真正具有抵抗HBV的免疫力做出正确评价，避免误导。Anti-HBs定量在10～100IU·L -1 之间的标本，ELISA结果为阳性，但此时抗体对HBV并无中和作用，仍有感染HBV的危险.只有“定量”在100IU·L -1 以上时才具有抵抗HBV入侵的作用 ［5］ ，因此对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具有重要意义。从方法学角度和自动化程度看，ECL法技术均优于ELISA法，但由于仪器、试剂较贵，医院可根据各自的工作实际、经济能力选用。
参考文献:
［1］陈慧英，张锦锋，岑小鹏，等.ELISA检测乙型肝炎HBsAg室内质控血清的试剂和使用［J］.上海医学检验杂志，2000，15（4）:203～205.
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［3］叶应妩，王毓三主编.全国临床检验操作规程［M］.第二版.南京:东南大学出版，1997，410～414.
［4］Duchna W，Hafner G，Navarro J，et al.1988.International multicenter evalu-ation of ELECSYS ? Ferritin on the ELECSYS ? 2010and1010analyzer［J］.Clinical Chemistry，44（Suppl）:A47.
［5］Heijtink RA，Schneeberger PM，Postma B，et al.Anti2HBs levels after hepatitis B immunisation depend on test reagents:routinely determined10and100IU/L seroprotection levels unreliable［J］.Vaccine，2002，20:2899～2905.
作者单位:1.暨南大学附属第一医院检验科，广东广州 510630;
2.广州邮电医院检验科，广东广州 510630.
作者简介:邱春嫦，女，主管检验技师，主要从事医学检验工作.
