王晖 ，刘红河 ，尹江伟
摘要:目的 建立反相高效液相色谱-二极管阵列检测法同时测定食品中维生素A和维生素E（α-生育酚）的方法。 方法 取一定量食品样品加入无水乙醇、氢氧化钾及焦性没食子酸，80℃水浴皂化30min，石油醚提取后，氮气吹扫浓缩致干后用流动相溶解，进样5μl分析;色谱条件:色谱柱Supelco C 18 柱（10cm×2.1mm，5μm），流动相甲醇:水（93+7），流速0.4ml/min，柱温40℃，DAD扫描波长范围210～370nm，检测波长325nm（Vitamin A）和294nm（Vitamin E）。 结果 维生素A在1.0～100.0μg/L浓度范围内线性良好，相关系数r=0.9998，维生素E在0.10～10.0mg/L浓度范围内相关系数r=0.9991。维生素A和维生素E的平均回收率在96%以上。 结论 该法快速、灵敏、准确，样品处理简便易行，可用于食品中脂溶性维生素A和E的同时测定。
关键词:维生素A;维生素E;高效液相色谱法
Simultaneous detection of retinal andα-tocopherol from foods by using high performance liquid phase chromatogra-phy.
WANG Hui，LIU Hong-he，YIN Jiang-wei.
（Guanlan District for Health Prevention，Shenzhen518100，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To determinate the concentrations of retinal andα-tocopherol in foods. Methods Food samples were added in anhydrous alcohol，potassium hydroxide and pyro-gallic acid.The mixture was shaken and saponified at80℃for30min-utes.The lipo-soluble vitamins were extracted by petroleum ether.The organic layer was dried by gas of N 2 ，dissolved by mobile phase，and analyzed by HPLC.The HPLC system consisted of Supleco C 18 column（10cm×2.1mm，5??m），mobile phase of methanol:water（93+7），flow rate:0.4ml/min，column temperature40℃，wavelength of scan from210nm to370nm，DAD detec-tor at325nm of retinal and294nm ofα-tocopherol. Results The linear ranges in determination of retinal andα-tocopherol were1.0～100.0μg/L（r=0.9998）and0.10～10.0mg/L（r=0.9991），respectively.The recovery rate of these vitamins was ower96%. Conclusion The method is sensitive，simply，rapid and accurate.It can be used to simultaneously determine lipo-soluble vitamins in foods.
Key words:Retinal;α-Tocopherol;High Performance Liquid Chromatography;Food Analysis
维生素A（Retinol）和维生素E（Tocopherol）是机体维持正常代谢和机能必需的脂溶性维生素 ［1］ 。维生素A又称为视黄醇，具有促进机体生长、维持表皮完整、生殖、骨骼及视觉等功能;维生素E又称为生育酚，其中以α-生育酚的生物效应最高，具有促进生育、抗衰老的作用。由于这两种维生素在外界环境中不稳定，易受光、氧等影响而被氧化破坏，影响因素较多，因此寻找合适的测定方法同时测定维生素A和E仍然是目前检验技术的难点。目前的国家卫生标准方法测定时间长、方法繁琐，可能导致样品中脂溶性维生素损失，回收率也不高。食品中维生素A和E的测定方法报道较少，主要有荧光法、HPLC等 ［2～5］ 。荧光法有诸多不足 ［2］ ;正相HPLC因溶剂纯度要求高、价贵，且要接触较多对人体有害的有机溶剂，一般尽量避免使用;反相HPLC测定法 ［3～5］ 样品经提取后，涉及到多次蒸发、溶解等步骤，前处理较麻烦、费时，易造成待测成份的破坏，导致测定结果偏低，灵敏度不高，对样品种类也有限制。本文建立了一种快速、灵敏、准确的反相高效液相色谱法同时测定食品中维生素A（retinol）和α-生育酚（α-tocopherol）的方法，样品处理简单，方法简便易行。并用建立的方法对几种食品中维生素A和E进行了测定，取得较好的结果。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和试剂 日本岛津LC-10A高效液相色谱仪，二极管阵列检测器;色谱柱:反相C 18 柱，10cm×2.1mm，5μm（美国Supleco公司）;超声波清洗器;N-EVAP TM 112氮气吹扫仪;LXJⅡ型离心沉淀机，0～4000r/min;0.45μm有机系针筒式微孔滤膜过滤器;Milli-Q plus超纯水系统（美国密理博公司）;维生素A和α-生育酚标准品，含量>99.0%（美国sigma公司产）。试剂除注明外均为分析纯。无水乙醇经脱醛处理后使用，具体操作方法为:取1.5g AgNO 3 用少量水溶解，倒入500ml无水乙醇中，加2g NaOH，摇匀，避光放置2d，隔半天摇1次，滤纸过滤后，滤液用旋转蒸发仪蒸馏，弃去最初和最后各50ml馏出液。
1.2 标准溶液的配制 储备液:精确称取维生素A和维生素E标准品用脱醛无水乙醇溶解使浓度分别为1.0mg/ml和0.10g/ml，储于-20℃冰箱中。工作液:测定前用脱醛乙醇稀释维生素A和维生素E储备液，使浓度分别为100μg/ml和1mg/ml。应用液:测定时先用紫外分光光度法标定其准确浓度，用脱醛乙醇将工作液稀释成一定浓度的混合标准系列溶液。
1.3 仪器条件 流动相甲醇:水=93+7，流速0.4ml/min，柱温40℃，波长扫描范围:210～370nm，检测波长分别为325nm（Vitamin A）、294nm（Vitamin E）。
1.4 样品来源 随机抽取深圳市各大超市市售奶粉、奶粉伴侣、米粉、婴幼儿葡萄糖、保健饮料和复合维生素片等样品。
2 实验方法
2.1 样品制备与处理 准确称取5.0～10.0g均匀化样品，置于200ml皂化瓶中，加40ml含16g/L焦性没食子酸的无水乙醇溶液，搅拌均匀后，加入20ml1+1KOH溶液，摇匀，避光80℃水浴中回流30min，不时摇匀，使皂化完全，皂化后立即置于冰水浴冷却;冷却后将样品转移到250ml分液漏斗中，用70ml石油醚洗2次皂化瓶，洗液并入分液漏斗，振摇萃取静置分层，收集石油醚层于另一分液漏斗，再用30ml石油醚提取水层，合并石油醚层。用去离子水反复洗分液漏斗中石油醚，直至用pH试纸检查水层不显碱性。将石油醚提取液经无水硫酸钠滤入100ml离心管中，在40℃水浴下氮气流吹干后迅速用流动相溶解定容至1.0ml，过0.45μm微孔滤膜后，进样5μl进行测定。整个操作过程严格避光。混合标准色谱图见图1。
图1 维生素A、E标准色谱图（略）
2.2 标准曲线的绘制 用脱醛乙醇将工作液稀释成混合标准系列溶液，使浓度分别为维生素A为（μg/ml）:0.10、0.20、0.50、0.70、1.0，维生素E为（μg/ml）:1.0、2.0、5.0、7.0、10.0。将混合标准系列溶液进样5μl进行测定。用峰面积比对浓度绘制标准曲线。
2.3 样品测定及计算 根据样品测定的色谱峰面积，在相应标准曲线查出对应的含量，结合所取的样品质量和定容体积计算样品相当的含量。
3 结果与讨论
3.1 色谱条件的选择 分别应用甲醇、甲醇:水（10+90）、甲醇:水（50+50）、甲醇:水（90+10）、甲醇:水（93+7）、甲醇:水（95+5）、甲醇:乙酸:水（0.5+0.1+99.4）、0.005～0.10mol/L浓度范围NH 4 Ac水溶液与甲醇按不同比例混合等几种流动相，经实验证明，在甲醇:水（93+7）条件下，几种脂溶性维生素之间，以及和样品中干扰物能达到较好的基线分离;在0.2ml/min～2.0ml/min范围内改变流动相流速，在流速为0.2ml/min～0.8ml/min几种维生素出峰时间合适，峰形较好，干扰少;对几种维生素标准溶液用紫外光谱仪进行扫描，发现维生素A在325nm、维生素E在294nm处有最大吸收峰，二极管阵列检测器 的紫外吸收光谱图也证实了这个结果，为保证二极管阵列检测器检测波长范围包含所需波长，我们确定波长扫描范围在210～370nm之间;进样量大可提高测定的灵敏度，但当进样量达到10μl以上时，峰形易出现分散、拖尾等现象，综合考虑，我们确定进样量为5μl，测定结果令人满意。
3.2 样品前处理条件的选择 食品中脂溶性维生素多是以酯类形式存在于食品中，而极少为游离状态，此外食品中的类脂类化合物也是食品中脂溶性维生素测定的主要干扰来源，因此需先将样品皂化，使待测维生素游离出来。选择合适的皂化条件如皂化剂浓度、皂化温度及皂化时间等使样品皂化完全对测定结果影响很大。通过比较几种不同的皂化剂及不同浓度，最后我们选择1+1KOH溶液20ml;从室温到100℃之间选择不同的皂化温度，发现温度越高皂化效果越好，但水温接近沸点时，水浴锅中水容易蒸干，条件不易控制，综合考虑，我们采用80℃水浴，在此条件下，皂化时间20min可基本皂化完全，考虑到不同样品要求皂化条件可能不同，我们选择皂化30min以保证各种样品能皂化完全。由于脂溶性维生素易被氧化，通过比较抗坏血酸、BHA、对苯二酚和焦性没食子酸等几种抗氧化剂，发现在皂化液中加入16g/L的焦性没食子酸，可有效地保护脂溶性维生素不被破坏。
3.3 标准曲线的线性范围和最低检测量 将混合标准系列溶液进样5μl进行测定。用峰面积比对浓度绘制标准曲线，维生素A在1.0～100.0μg/L浓度范围内线性良好，相关系数r=0.9998;维生素E在0.10～10.0mg/L浓度范围内相关系数r=0.9991。以基线噪声三倍峰面积对应的维生素A和维生素E含量作为最低检测限，测得维生素A最低检测量为0.8ng;维生素E的最低检测量为90.7ng。
3.4 加标回收试验 取同一食品样品4份，其中两份测定本底值，另两份加入一定浓度的维生素A和维生素E标准溶液，处理后进样5μl，测定峰面积，代入标准曲线，计算结果，从表1结果可知，维生素A和维生素E加标回收结果较好，回收率在96%以上，可满足分析要求。
表1 维生素A和E加标回收结果（略）
3.5 精密度试验 取两份食品样品进行精密度试验，重复测定7次，RSD在3.36%～4.40%之间，精密度较好。结果见表2。
3.6 与国家标准测定方法比较 称取同一样品14份，7份用本法测定，另7份用国家标准测定方法-GB/T5009.82-2003 ［6］ 测定。结果见表3，经两样本均数比较t检验，P值均大于0.20，两种方法结果无显著性差异，说明本法测定结果与国家标准分析方法一致。
3.7 样品测定结果及分析 测定了超市抽取的119份不同类样品，结果见表4。
表2 维生素A和维生素E精密度测定结果（略）
表3 不同方法测定结果比较（略）
表4 样品的测定结果（略）
调查结果显示，部分样品两种脂溶性维生素含量均未达到商品包装盒上标示值，有些强化食品中该两种维生素的添加量部分或全部达不到国家卫生标准要求的添加量，其中相当一部分为婴幼儿产品。如长期使用这些添加量不足的产品，对处于生长发育的婴幼儿健康将产生不良影响。因此，应加强市场上强化食品特别是婴幼儿强化食品的卫生监管力度，不能停留在以前的只是针对卫生指标中有毒有害成份的监测，对其营养成份同时也要加强监测。不断开发食品中各种营养成份的相应检测方法也应该受到各相关部门的重视。
参考文献:
［1］陈炳卿.营养与食品卫生学［M］.第3版.北京:人民卫生出版社，1997，36.
［2］Thompson JN，Erdody P，Maxvel WB.Simutaneous Fluorometric determi-nation of Vitamins A and E in human serum ang plasma［J］.BiochemMed，1973，8:403.
［3］De Leenheer AP，De Bevere V，De Ruyter MGM，et al.Simutaneous de-termination of retinal andα-tocopherol in human serum by high perfor-mance liquid chromatography［J］.J.Chromatogr，1979，162:408.
［4］Nichoalds GE.Simutaneous determination of retinal andα-tocopherol in serum or plasma by liquid chromatography［J］.Clin.Chem，1983，29（4）:708.
［5］郑明慈.高效液相色谱法同时测定维生素A/E及胡萝卜素［J］.华夏医学，1999，12（2）:123.
［6］GB/T5009.82-2003食品中维生素A和维生素E的测定方法［S］.中华人民共和国卫生标准.
