贺连华 ，扈庆华 ，石晓路 ，郑琳琳 ，李庆阁 ，张佳峰 ，庄志雄 ，刘小立 ，张顺祥 ，王冰 ，吴平芳 ，刘涛
摘要:目的 建立改良分子信标实时PCR快速检测大肠杆菌O 157 :H 7 的快速方法。 方法 根据GenBank公布O 157 :H 7 的rfbE保守序列，设计一对引物和改良分子信标探针，用FAM荧光剂标记探针的5'端，建立改良分子信标实时PCR检测O 157 :H 7 的反应体系，应用于食物中毒快速诊断和食品微生物检测。 结果 共检测11种细菌，只有大肠杆菌O 157 :H 7 有荧光信号，其余10种全无荧光信号，且与其他细菌无交叉反应，DNA灵敏度为64fg，菌液灵敏度为59cfu/ml或2cfu/PCR反应体系。应用改良分子信标实时PCR反应体系检测10株O 157 :H 7 均出现特异的荧光信号，无干扰。对89份食品样品进行检测，5份O 157 :H 7 实时PCR阳性，其余样品为阴性，检测仅需2h。5份阳性样本，经传统方法培养，有3份检出大肠杆菌O 157 :H 7 。 结论 改良分子信标实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于大肠杆菌O 157 :H 7 食物中毒的快速诊断和食品微生物检测，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。
关键词:大肠杆菌O 157 :H 7 ;改良分子信标;实时PCR
Rapid Detection of E.coli O 157 :H 7 by using modified beacons and real-time PCR.
HE Lian-hua，HUQing-hua，SHI Xiao-lu，et al.
（Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen518020，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To establish a method for rapid detection of E.coli O 157 :H 7 from samples of contaminated food by using modified molecular beacons and real-time PCR. Methods The primers and modified molecular beacons were designed based on the core sequence of rfbE gene published on GenBank for detection of E.coli O 157 :H 7 .The probe was labeled with FAM at5'end.The molecular beacons and primer setwas tested against numerous strains from11different bacterial species and used for rapid detec-tion and diagnosis of ffod poisoning. Results For the modified molecular beacons-based real-time PCR assay，the sensitivity was64fg，59cfu/ml or2cfu/PCR reaction.There was no cross-reaction with other bacteria as control.The real-time PCR assay was used to detect10E.coli O 157 :H 7 and no false signals were observed.89food samples were tested and E.coli O 157 :H 7 was de-tected from5samples by real time PCR.3samples were positive for E.coli O 157 :H 7 detected by traditional culture method.The overall test could be finished within2hours. Conclusion The modified molecular beacons-based real-time PCR assay is rapid，sensitive and specific for detection of E.coli O 157 :H 7 from contaminated food.
Key words:E.coli O 157 :H 7 ;Modified molecular beacon;Real-time PCR
肠出血性大肠杆菌（Entero Hemorrhagic E.coli）O 157 :H 7 是近十年来认识的一种引起人类出血性结肠炎（Hemorrhagic coli-tis HC）和溶血性尿毒综合怔（Hemolytic aremic syndrom HUS）的肠道致病菌 ［1］ 。由于E.O 157 :H 7 感染剂量极低，在食入不足5个细菌就可引起疾病，且病情发展快，死亡率高，近年在欧美、日本等国已多次爆发流行，对人类的健康构成了重大的威胁 ［2］ 。我国1986年已发现E.O 157 :H 7 感染病人，并在安徽、江苏等地爆发了食物中毒 ［3］ 。O 157 :H 7 也可以感染动物，并在实验动物中引起类似于出血性肠炎或溶血性尿毒综合怔等症状，表明是一种人畜共患病 ［4］ 。
我国目前对E.O 157 :H 7 等病原体大多数是传统的细菌学检测，细菌从分离、培养、鉴定需要1周左右的时间，耗时耗材，而且检出率很低，显然对E.O 157 :H 7 等恶性病原体爆发的诊断不适宜 ［5］ 。自1995年美国PE公司提出实时PCR检测原理后，实时PCR以其快速、定量、无需后电泳、无交叉污染等突出优点而被广泛采用 ［6］ 。其原理为退火阶段，分子信标与生产的靶序列结合发出荧光，在延伸阶段则脱离靶序列而不干扰扩增，随着循环次数的增加，与摸板结合的分子信标的量亦增加，最终的荧光强度与模板量成正相关。改良分子信标是在分子信标的基础上提出的一种新型分子探针，以它为基础建立的实时PCR技术可以更好地实现实时PCR检测多种致病菌。本文采用改良分子信标技术建立E.O 157 :H 7 的实时PCR方法，和国家标准方法比较，显示新方法的准确性和灵敏度，并用于食物中毒快速诊断和食品致病菌筛查。与常规PCR方法相比，由于引物和探针的“双保险”，显示特异性更强，并具有操作简单、可定量、污染少等优点。
1 材料与方法
1.1 实验菌株 包括1株沙门氏菌、1株志贺氏菌、1株EPEC、1株EIEC、1株ETEC、1株O 157 :H 7 、1株金黄色葡萄球菌、1株蜡样芽孢杆菌、1株李斯特菌、1株变形杆菌、1株副溶血性弧菌，全部菌株均购自中国药品生物制品检定所。
1.2 模板提取 全部菌株经LB增菌培养过夜后，菌体用500μl TEbuffer悬浮，加入终浓度为1%SDS和0.2μg/μl的蛋白酶K，55℃作用1h后，用酚-氯仿抽提DNA。或取1ml菌液，离心沉淀，制备菌悬液，煮沸，取上清夜5μl用于实时PCR反应。
1.3 引物和探针设计 根据GenBank公布的O 157 :H 7 rfbE的序列并比较分析，自行设计一对引物和探针，引物和探针均由上海Sangon公司合成，探针用FAM标记。
1.4 PCR反应条件 反应总体积为25μl，内含5μl模板，2.5μl110хPCR缓冲液，1.5mmoMgc12，0.25mmol/Ld-NTP，IUTaq酶，25pmol引物，25pmol探针。实时PCR反应参数为94℃预变性5min，40个循环中94℃变性30s，52℃退火40s，72℃延伸30s。用icycle荧光PCR扩增仪（Bio-Rad）检测退火的荧光。
1.5 结果判断 检测样本Ct值小于等于35.0时，测定结果有效，可直接报告样本阳性;检测样本Ct值大于35.0且小于40时，重复一次，如果Ct值仍小于40，且曲线有明显的对数增长期，可报告样本阳性，否则报告样本阴性;检测不到样本Ct值时，报告样本阴性。
1.6 特异性检测 用上述11种细菌作对照，对O 157 :H 7 进行rfbE改良分子信标实时PCR扩增。取O 157 :H 7 作为代表株，包括DNA灵敏度分析和菌液灵敏度分析。DNA灵敏度分析为按常规DNA提取方法提取模板DNA用Ultrospec2000紫外可见光核酸分析仪（Phamacia公司）测DNA的浓度。然后进行5倍稀释，每个稀释度取1ul用于实时PCR反应。菌液灵敏度分析为O 157 :H 7 增菌后，进行10倍稀释，工作10个稀释度，然后依次取10个稀释度的1ml菌液进行实时PCR反应。
2 结果
2.1 特异性分析 11种细菌经改良分子信标体系检测，只有O 157 :H 7 有荧光信号其他细菌无荧光信号，DNA灵敏度为64fg/μl，菌液灵敏度为59cfu/ml或2cfu/PCR反应体系。
2.2 样本检测结果 对89份样本以改良分子信标实时PCR快速检测结果见表1。
表1 89份样本以改良分子信标实时PCR O 157 :H 7 的检出情况（略）
对其中5份PCR法检出O 157 :H 7 阳性的样本，用金标法筛选，显示均为强阳性;用传统培养法，检测检出3份。
3 讨论
本文在改良分子信标技术的基础上，建立了实时PCR快 速检测O 157 :H 7 的方法。结果表明此方法检测DNA灵敏度为64fg/ul，菌液灵敏度为59cfu/ml或2cfu/PCR反应体系，以及特异性强，与对照组11种细菌无交叉反应，且操作简单，结果观察直观明了，可一次检测96份样品，适用于O 157 :H 7 食物中毒的快速诊断和大量样品的检测，无交叉污染。对于大便和呕吐物标本，从样品处理到检测结果仅需2h，对食品样本仅需1d时间。在建立单一实时PCR快速检测细菌的基础上，最终实现多重实时PCR同时诊断10种食源性致病菌，满足常见细菌性食物中毒快速诊断的要求。
改良分子信标探针是为了提高杂交效率，在原来分子信标的基础上提出来的。改良分子信标的突出特点是将分子信标的臂部分也作为靶识别序列，而不仅仅是用于形成发夹结构的无关添加序列。对于同样长度的检测靶序列，改良分子信标比分子信标更短，而且由于臂序列不再悬空，因而与靶序列的结合更紧密。改良分子信标比分子信标更易设计且成功率更高，同时对扩增条件要求不严。
本文所建立的实时PCR技术快速检测方法，可用于细菌性食物中毒和食品微生物的检验，随着生态环境的变化和抗生素的滥用，许多致病菌引起的临床症状越来越不典型，常常需要同时检测多种细菌才能确定病原。另外在食品微生物检验中，如果只采用单一分子信标体系检测单一细菌，就会出现成本高的缺点。因此，又快又能同时检测多种病原微生物的多重实时PCR技术检测多种细菌是未来发展方向。
参考文献:
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