许丽 ，杨应周 ，谭卫国 ，林世平 ，胡志上 ，吴清芳 ，张玉华
摘要:目的 探讨随机扩增多态性DNA（Randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）技术在分枝杆菌分型诊断中优化条件及其应用价值。 方法 优化RAPD技术扩增分枝杆菌DNA的条件，并分别扩增深圳市临床病人分离株DNA，对比RAPD电泳条带特征。 结果 以条带稳定、丰富、清晰为标准，确定引物1RAPD最佳反应条件为:50μl反应体系中，含100ng模板DNA，2.5mmol/L MgCl 2 ，2U DNA聚合酶，引物0.5μmol/L，dATP、dGTP、dCTP和dTTP各250μmol/L，反应40个循环，每个循环为:94℃1min，36℃1min，72℃2min。所扩增结核杆菌临床分离株的DNA条带丰富、清晰，各条带差异较明显。 结论 RAPD技术能较好地鉴别MTB和NTM。
关键词:分枝杆菌;非典型性;结核杆菌;RAPD;分型
The optimized condition for differentiation of Mycobactreium strains by using RAPD and its appliation in strain typing and diagnosis.
X Li，YANG Ying-zhou，TAN Wei-guo，et al.
（Shenzhen Municipal Chronic Disease Hospital，Shenzhen518020，Guangdong，P.R.China）
Abstract:Objective To explore the optimized condition for type differentiation of Mycobacteria strains and its value in applifi-cation by means of randomly amplified polymorphic DNA（RAPD）analysis. Methods RAPD condition for amplifying Mycobacteria DNA of clinically separated Mycobacteril strains from patients in Shenzhen was optimized，and then compared the fea-tures of RAPD electrophoresis strips. Results The best reaction condition for RAPD，taking stable，abundant and clear strips as criteria，were as the follows:in50μl reaction system，there was100ng template DNA，2.5mmol/L MgCl 2 ，2U DNA polymerization enzyme，0.5μmol/L primer and250μmol/L of dATP、dGTP、dCTP and dTTP respectively;40reaction cycles，whose cycle procedure was:94℃1min，36℃1min，72℃2min.At the above reaction conditions for RAPD，DNA of climically separated Mycobacteria strains were amplified，and the electrophoresis strips were abundant，clear，and evidently different from each other. Conclusion Mycobacterium tuberculosis and no-Mycobacterium tuberculosis can be differentiated by RAPD.
Key words:Mycobacteria tuberculosis;Non-Mycobacterium tuberculosis;RAPD;Type differentiation
现今非结核分枝杆菌病（Nontuberculous mycobacteria，简称NTM）的发病率呈逐年上升的趋势，部分肺结核病人同时感染NTM。临床上NTM的误诊误治问题仍然严重，分枝杆菌菌型鉴定对结核病的诊断、治疗、追踪可能传播途径、明确菌株与临床表现的相关性等都有极其重要的意义 ［1］ 。现结核分枝杆菌菌型鉴定主要是以RFLP、PFGE和PCR为基础的分型方法 ［2］ ，但操作复杂、耗材昂贵、特异性和重复性差的缺点，难以大规模应用临床。我们在试验中优化RAPD技术条件，并进行结核分枝杆菌（简称MTb）菌型鉴定，证实RAPD技术在结核分枝杆菌的分型诊断中有重要应用价值。
1 材料与方法
1.1 菌株来源 146株人型结核分枝杆菌为深圳市2003年1月～12月各区级慢性病防治院的病人分离株，7株脓肿分枝杆菌为深圳市某医院脓肿分枝杆菌爆发感染时分离的菌株，其他NTM为深圳市慢性病防治院细菌库保存菌株。
1.2 分枝杆菌基因组DNA的提取 取一定量分枝杆菌，加入567μl的TE缓冲液，用吸管反复吹打使之混悬。加入30μl10%的SDS和3μl20mg/ml的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h。加入5mol/l NaCl100μl，充分混匀，再加入80μl CTAB/NaCl溶液，混匀，于65℃温育10min。再加入等体积的三氯甲烷/异戊醇，混匀，离心4～5min。将上清液转入一个新管中，重复二次。加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，用一个封口的离心管将沉淀转移至1ml的70%乙醇中洗涤。离心5min，弃上清，沉淀重新溶于100μl的TE缓冲液。
1.3 RAPD引物设计 对文献发表的随机引物5'端进行随机修改，获得8条新的随机引物:
引物1:GCGTAGGCGTCGGTGACAAA引物2:ACGCTCAACGCCAGAGACCA引物3:ATCATACCTTCTGAT引物4:GACTAACGTCAATCA引物5:AACGGTAGCACGAAG引物6:GAGCGTTTGAATGAA引物7:GCTCTTGTCTCACTT引物8:GAGGGAAGGATTTCC以上引物由上海生工生物技术有限公司合成。
1.4 RAPD-PCR扩增 以H37Rv（结核分枝杆菌标准株）和其它临床分离结核分枝杆菌菌株基因组DNA为模板，依次选用合成的8条随机引物，在不同的Mg 2+ 浓度、引物浓度、Taq酶浓度、靶DNA浓度、循环次数和退火温度下进行单引物扩增。
1.5 RAPD-PCR产物检测 2%的琼脂糖凝胶电泳后观察结果，用凝胶成像分析系统拍照保存。
2 结果
2.1 以H37Rv基因组DNA为模板，对引物反应条件优化。
2.1.1 引物1的反应条件优化 当退火温度为34℃、循环次数为40次时（每个循环为94℃1min，34℃1min，72℃2min），选用不同的模板DNA浓度、引物浓度、Mg 2+ 浓度和TaqE量进行扩增，扩出的条带杂乱、不稳定;升高退火温度至38℃，引物1扩增出的条带明亮，但带型单一;改变退火温度为36℃，循环数不变，用不同的模板DNA浓度、引物浓度、Mg 2+ 浓度和TaqE量优化引物反应条件，得到结果如图1。循环数减少为30时，扩增出的条带比图1明显减弱，故仍选用40作为反应循环数（见图1）。
图1 引物1对H37Rv基因组DNA扩增图（优化条件）（略）
M:Marker 1:100ngDNA，2.0mmol/LMgCl2，2U TaqE，0.5μmol/L引物;2:100ngDNA，1.5mmol/LMgCl2，1U TaqE，0.5μmol/L引物;3:100ngDNA，2.5mmol/LMgCl2，2U TaqE，0.5μmol/L引物;4:100ngDNA，2.5mmol/LMgCl2，1U TaqE，0.5μmol/L引物;5:50ngDNA，2.5mmol/LMgCl2，2U TaqE，0.4μmol/L引物;6:50ngDNA，2.5mmol/LMgCl2，1U TaqE，0.4μmol/L引物;7:50ngDNA，2.0mmol/LMgCl2，2U TaqE，0.4μmol/L引物;8:50ngDNA，2.0mmol/LMgCl2，1U TaqE，0.4μmol/L引物;9:50ngDNA，1.5mmol/LMgCl2，2U TaqE，0.4μmol/L引物;10:50ngDNA，1.5mmol/LMgCl2，1U TaqE，0.4μmol/L引物;11:阴性对照
综合上述实验，以条带稳定、丰富、清晰为标准，确定引物1RAPD最佳反应条件为:50μl反应体系中，含100ng模板DNA，2.5mmol/L MgCl 2 ，2U DNA聚合酶，引物0.5μmol/L，dATP、dGTP、dCTP和dTTP各250μmol/L。反应40个循环，每个循环为94℃1min，36℃1min，72℃2min。
2.1.2 其他引物反应的退火温度和Mg 2+ 浓度优化 参照引物1的最佳反应条件，对其他引物反应的退火温度和Mg 2+ 浓度进行优化，结果发现，引物3、4、5和6均选用36℃的退火温度、2.5mmol/L MgCl 2 扩增，所得综合带型稳定、丰富、清晰。由于引物2、7、8扩增得到的条带单一、不够稳定，不适宜用作菌株分型来鉴定结核分枝杆菌，故淘汰这三条引物。
综合上述实验，选出引物1、3、4、5、6进行分枝杆菌鉴定，反应条件为:在50μl反应体系中，含引物0.5μmol/L，100ng模板DNA，2U DNA聚合酶，dATP、dGTP、dCTP和dTTP各250μmol/L， 2.5mmol/L MgCl 2 。反应程序为:94℃1min，36℃1min，72℃2min，40个循环。
2.2 用引物1扩增MTb和NTM基因组DNA
2.2.1 采用以上述优化条件用引物1扩增MTb，结果如图2。
图2 引物1扩增各种分枝杆菌DNA图（略）
1:DNA Marker;2:脓肿分枝杆菌;3:耻垢分枝杆菌;4:龟分枝杆菌;5:脓肿分枝杆菌;6:金色分枝杆菌;7:偶然分枝杆菌;8:偶然分枝杆菌变种;9:胞内分枝杆菌;10:H37Rv（结核分枝杆菌标准株）;11:H37Ra（结核分枝杆菌去毒株）;12:结核分枝杆菌临床分离株
图2显示，分枝杆菌鉴定，引物1扩增的DNA条带丰富、清晰，各泳道差异较明显，能比较好地鉴别MTb和NTM。
2.2.2 引物1扩增临床分离的MTb组DNA 在与上述同样反应条件下，应用引物1成批扩增临床分离的MTb基因组DNA（MTb来自深圳市各区级慢性病防治院的病人分离株），带型基本稳定，显示引物1有一定的临床应用前景，结果如图3所示。
图3 引物1扩增临床人型结核分枝杆菌DNA图（略）
2.3 同样优化条件下用不同引物分别扩增MTb和NTM基因组DNA
2.3.1 在优化条件下引物3扩增MTb，结果见图4。
图4 引物3扩增各种分枝杆菌DNA电泳图（略）
M:marker;1-11同图2中的2-12。
引物3扩增的DNA条带明亮，能在一定程度上区别MTb和某些NTM，但带型区别不如引物1明显。
2.3.2 用引物3扩增临床分离的MTb基因组DNA 实验中所用12株结核分枝杆菌均为深圳市各区慢性病防治医院的病人分离株，扩增所得带型不够稳定，显示引物3应用前景有限，结果如图5所示。
图5 引物3扩增临床结核分枝杆菌DNA图（略）
2.4 引物4、5、6分别扩增MTb和NTM基因组DNA 优化条件下引物4、5、6分别扩增MTb，结果发现，引物4有一定的分型能力，但条带的稳定性、特异性都不如引物1。另外5条引物，在优化后的反应条件下，由于条带的稳定性差、带弱、带型单一或者带型相似性大、易混淆等原因，不宜用来进行分枝杆菌分型以鉴别结核分枝杆菌。引物6扩增各种分枝杆菌DNA带型相似性较大，缺乏鉴别结核分枝杆菌的能力。
3 讨论
RAPD是继RFLP之后发展起来的一种建立在PCR基础上的新的检测基因组多态性的基因型分型方法，它是以一系列不同的随机排列碱基顺序的寡核苷酸单链为引物，对所研究的基因组DNA进行单引物扩增。RAPD-PCR对反应条件高度依赖。扩增条件的优化组合是获得稳定、可靠的扩增条带的关键。与其他分子生物学常用的DNA指纹分析方法，如RFLP、PFGE等相比，其结果多态性相近，且具有快速、简便、模板要求不是太高和实验费用低廉等优点，特别是无需预知靶DNA的核苷酸序列，无需进行探针标记 ［3］ 。因此，在基因组DNA图谱的构建、物种同源性研究、种群关系研究等得到了广泛应用，在微生物的病原学检测、分型、DNA指纹鉴定和医院感染等方面应用日益增多。
本文采用RAPD-PCR对分枝杆菌的分型和鉴定进行了研究。鉴于RAPD-PCR对反应条件高度依赖的特点，我们首先对包括不同引物长度、引物浓度、模板浓度、镁离子浓度、反应DNA聚合酶浓度、退火温度和循环次数在内的扩增条件进行优化，结果发现，设计的8条随机引物中3条引物可用于MTb和NTM的鉴别，长度为15～20个碱基的引物分型效果较好;在引物浓度为0.5μmol/L、退火温度36℃、模板浓度选用100ng、镁离子浓度为2.5μmol/L、反应DNA聚合酶浓度一般以2U和循环40次时，扩增所得的条带稳定、丰富、清晰。最后采用上述优化条件进行深圳市结防机构临床分离的结核杆菌菌株，发现扩增的DNA条带丰富、清晰，各道差异较明显，进一步证实RAPD能比较好地鉴别MTb和NTM。
但RAPD方法的主要缺点是重复性差，需要重复实验数次，当3次以上扩增的DNA条带相同时，才可以确定结果。重复性差的问题从仪器和操作入手，可以得到改善。
参考文献:
［1］熊礼宽.结核病实验诊断学［M］.北京:人民卫生出版社，2003，1.
［2］刘敬华，万康林，成诗明.结核分枝杆菌株水平鉴定技术及其研究进展［J］.中华流行病学杂志，2003，24（12）:1153.
［3］斐秀英，许红平，王丽.结核分枝杆菌DNA两种提取方法比较［J］.宁夏医学院学报，2000，22（6）:391.
