关键词：化学发光法，酶联免疫试验，时间分辨荧光免疫测定
本文作者:肖征 周薇薇 白立彦 赵莉萍
Comparison of chemiluminescence, ELISA and time-resolved fluoroimmunoassay in detecting Hepatitis B markers
肖征，副主任医师，副教授
周薇薇，主管技师
白立彦，主管技师
赵莉萍，主管技师
解放军总医院微生物科，100853 北京
Zheng Xiao, Weiwei Zhou, Liyan Bai, Liping Zhao
General Hospital of PLA, Beijing, 100853 PRC
Abstract
Subject: To compare three deferent assays to see their abilities in detecting hepatitis B markers.
Methods：By using Chemiluminescence (CL), ELISA and Time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA), 189 serum samples were tested for hepatitis B markers, then the results were analyzed.
Results: The three assays all can detect as low as 0.1ng/ml of HBsAg. But in HBcAb, The CL showed the highest sensitivity, ELISA showed the lowest sensitivity. The coincidences of the three methods in detecting HBsAb, HBeAg, and HBeAb are normally above 95%, but for HBcAb, the coincidence was 83.23% between TRIF and CL, and 85.19% between TRIFA and EIA.
Conclusion: There were not much difference among these three methods regarding their abilities in detecting hepatitis B markers, but the maneuver flexibilities of each method differed a lot. One should consider his own lab's situation before making choice.
Key words: chemiluminescence, ELISA, time-resolved fluoroimmunoassay
自二十世纪七十年代以来，许多高灵敏度的测定方法应用于临床免疫学检测。其中，酶联免疫法应用最广。近年来发展起来的CL与TRFIA测定据称是灵敏度非常高的方法[1,2,3]。本文就这三种方法对乙肝免疫标志物的测定作一比较，以下结果供大家参考。
材料与方法
1.试剂与器材：
时间分辨免疫荧光测定为上海新波生物公司生产的乙肝两对半测定试剂盒，及由该公司提供的洗板机、孵育器和时间分辨免疫荧光测定仪以及分析判定结果软件系统。
酶联免疫方法试剂为SORIN公司（HBsAg）、科华公司（HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）产品； 仪器有洗板机（WELLWASH4）、酶标比色仪（READER 230S），部分试验在FAME（全自动开放式酶免分析仪）上进行。
化学发光法为强生公司Vitros Eci化学发光免疫测定系统及配套的专门试剂盒。
标本为临床检测乙肝标志物的血液标本，分离血清，-20℃保存备用。HBsAg标准品购自北京市临床检验中心（2ng/ml）,使用时稀释至所需浓度。
2.方法
ELISA按产品说明书进行。主要步骤有：加样、孵育、洗板、加酶或底物、显色、比色。其中HBcAb测定的样本经1：30稀释。
CL法为全自动系统，设计好标本位置、检测项目，按开始键即可 TRFIA测试步骤与ELISA法相似，HBcAb测定样本亦经1：30稀释，在最后一步比色为使用时间分辨免疫荧光测定仪测定发光度。
变异系数(CV): 取0.5ng/ml HBsAg一次做20个测试孔，以测得值（ELISA为OD值，CL为相对荧光强度，TRFIA为定量值）计算批内差异。统计5个批次测定的结果计算批间差异。
3.结果判断
ELISA法以标本OD值与临界OD值的比值(S/CO)大于1为阳性,核心抗体测定则相反，以小于0.5为阳性。
CL法以标本荧光强度/标准荧光强度的比值(相对荧光强度，RF)大于某一定值（1～1.2）为阳性，核心抗体测定则相反，以小于1.0为阳性。
TRFIA为半定量法，每批标本中要作一个标准曲线,再由此将测得结果用配套计算机进行计算、转换为被测定物的含量。
结果
1. 三种方法检测HBsAg灵敏度的比较见表1。三种方法都可以测出0.1ng/ml的低浓度HBsAg，对该样品的测定灵敏度相差不大。对HBcAb的测定以CL的灵敏度最高，ELISA最低。
2. 三种方法变异系数的比较见表2。三种方法中，以ELISA的批内、批间差异值最大，CL与TRFIA均较低。
3.对189份标本的HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb五个项目分别测定的结果的一致性比较见表3与表4。本文主要比较TRFIA与现有方法的差别，故未做ELISA 与CL的比较。对HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb的检测，相互符合率均在95%以上，但对HBcAb的检测符合率， TRFIA与CL为83.23%，TRFIA与EIA为85.19%。
讨论
1.从灵敏度上来看，三种方法的差别似乎不大。但TRFIA法此次试剂盒的标准曲线的低端定在0.1ng/ml，对0.1的样本测定值为0.09ng/ml，虽然低于其标准曲线，但其荧光读数已高于阴性背景均值的3倍标准差，故可报为阳性。
2.对乙肝五项的测定，总体来说，灵敏度差别亦不大。差别较大的是核心抗体测定。除了方法学上的差异外，影响结果的可能性因素还有：ELISA法的试剂厂家有意调低了核心抗体的阳性率；而CL法阳性率高的可能因素也许与其测定时不稀释标本有关。
3.不确定因素对实验造成的影响会导致非特异性反应的发生。这一点，CL法出现的相对少一些，其批间差异只有4-5.5%，这是因为它是全自动操作，重复性好。但我们也遇到过CL法HBsAg的RF值为1～2的标本（大于1.0为阳性），经复查后为阴性。批间差异、批内差异越小，样本测定的重复性越好，这三种方法中，以ELISA差异最大，故ELISA法不适于作定量测定。而CL和TRFIA二者均较小，用于定量测定的项目也较多。
4.TRFIA法是最近应用于临床的一种高灵敏度的免疫学检测方法。它的基本原理是延迟检测寿命较长的特异性激发荧光以排除非特异性及背景荧光的干扰。应用自动化的时间分辨免疫荧光检测仪可以自动完成特异性荧光的检测并进行浓度换算，从而获得较好的灵敏度和特异性。
TRFIA法的另一优点是它的线性范围比较宽，方便进行定量。这对观察病人的感染进展情况，对治疗有无应答可得到最直接的变化数据。对于临床来说，对表面抗原、表面抗体和核心抗体的定量测定更为重要。CL法（仪器）也可以对表面抗体的测定定量，但对其它几项不能定量，只能通过RF的高低来做相对的定量估计。ELISA法的测定项目则都不作定量，在常规工作中，我们将在CUT-OFF值三倍以内的阳性标本报告为弱阳性。
TRFIA法还有一个优点是它的最终结果比色对时间要求不高，反应终止后结果稳定，只要反应板的液体不挥发，它的比色测定值能稳定相当长时间。
5.化学发光法主要的优点在于其操作方便、结果稳定，少量标本时相对快速简便，但本文中化学发光仪，标本处理速度理论最高值只有90测试/小时。实际运行中速度还要慢些。而ELISA法和TRFIA法则适合于大批量标本的检测。另外，CL法的成本也较高，还有因出现故障而浪费可测试验数的情况，这更增加了它的成本。
6.ELISA法的优点在于它操作简单、适合于大批量标本的测定，且成本低廉。其灵敏度也很好。但由于它的灵敏度较高，各个标本的操作间隔小，容易互相影响（污染）。所以，对于阳性标本，应以适宜的方法复查，以减少误报。
7.TRFIA法的灵敏度、特异性均较好，试验结果可以保存较长时间。其定量是它的优点，同时也是它的弱点。如果一次试验的标准没做好，这一批的结果可能都会受影响，甚至完全出不了结果。而乙肝标志物的检测有时不一定要精确定量，有些项目的结果只要有大致的浓度就能提供给临床足够的信息量了。
从以上实验结果可以看出，三种方法各有特点。从目前临床实验室免疫学检测方法的发展状况来说，现在已是ELISA法的发展应用顶峰时期，下一步取代它的，是CL？TRFIA？还是其它的方法？由于我们评价的TRFIA法试剂是一刚刚开发出来的产品，可检测项目也不多，如能进一步改进，相信它会更多地被临床实验室接受。
参考文献
1.时间分辨荧光分析法（TRFIA），coolautumn，http://www.clinet.com.cn/edu/
resource/instrument/2001093002.htm，
2.李振甲等，时间分辨荧光免疫分析技术与应用。北京：科学技术出版社，1996，49
3. Madersbacher,-S; Berger,-P , Antibodies and immunoassays. Methods. 2000 May; 21(1): 41-50
4.王桂莲等，甲胎蛋白、癌胚抗原时间分辨荧光法与化学发光法比较。南通医学院学报，2000，20（2）：159
5.鞠北华等，解离-增强时间分辨荧光免疫分析法检测HBVM的临床应用。江西医学检验，2003，21（3）：200-201
肖征 男 1960年10月出生，现任解放军总医院微生物科副主任医师、副教授。
1983年北京军区军医学校检验专业毕业，1989年军医进修学院研究生毕业并获硕士学位，1998年赴英国Edingburgh皇家医学院进修半年。在微生物科工作期间，主要负责了大型仪器的引进及开发，病毒的免疫学检测试验的开展，艾滋病实验室的建立及标本检测。完成的课题有“艰难梭菌A毒素的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立”，“重复片段引物用于院内感染流行病学研究”等。
主要研究：院内感染的细菌流行病学研究，病毒感染的免疫学检测。发表文章，约十篇
