The evaluation of methods for detecting susceptibility of Staphylococcus aureus to vancomycin
马筱玲1，张涛2，戴媛媛1，陈建中3
（1.安徽医科大学附属省立医院，安徽合肥 230001；2.蚌埠医学院微生物教研室，安徽蚌埠 233003；3.安徽卫生职业技术学院，安徽合肥 230061）
MA Xiao－ling，ZHANG Tao，DAI Yuan－yuan，CHEN Jjian－zhong
（Department of Clinical laboratory，Anhui medical university affiliated Anhui Provicial Hospital，Hefei 230001，China）
ABSTRACT
OBJECTIVE：To investigate the effective methods for detecing susceptibility of Staphylococcus aureus to vancomycin.
METHODS：A isolate of h－VRSA isolated from clinical specimen was inoculated on the increasing concentration of vancomycin agars. Vary degree vancomycin resistant S. aureus were obtained. The susceptibility of these S. aureus to vancomycin were tested by agar screening test，broth microdilution method，E－test，disk diffusion method and automated methods.
RESULTS：Agar screening test，broth microdilution method and E－test can detect the vancomycin－intermediate S. aureus（VISA），but disk diffusion method and automated methods can not detect VISA.
CONCLUSION：Broth microdilution method and E－test are acceptable methods for susceptibility testing of S. aureus to vancomycin. Laboratories using automated methods and disk diffusion method as routinely susceptibility test should consider adding a vancomycin agar screen plate to enhance detection of VRSA and VISA.
Key words：Staphylococcus aureus；vancomycin；resistance；methods
耐万古霉素金黄色葡萄球菌的出现是临床抗感染治疗中非常棘手的问题，为了防范这一严重耐药菌在医院内迅速传播，2005年美国临床和实验室标准化研究所（CLSI/NCCLS）[1]的“抗生素敏感性试验执行标准”中增加了万古霉素耐药金黄色葡萄球菌（VRSA）和万古霉素中介耐药金黄色葡萄球菌（VISA）的检测方法和判断标准。本文使用体外诱导方法在实验室内构建一系列对万古霉素不同程度耐药的金黄色葡萄球菌菌株，并用于对万古霉素药敏试验方法进行评价。
1. 材料和方法
1.1 菌株 临床标本分离的金黄色葡萄球菌，经菌谱分析法确定为异质性万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌（h－VRSA），编号为10827[2]。金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213、ATCC25923和粪肠球菌标准菌株ATCC51299购于中国药品生物制品检定所。
1.2 药物 盐酸万古霉素由美国礼来公司生产，有效期内使用，使用前用金葡菌标准菌株ATCC29213进行质控。
1.3 培养基及药敏纸片 脑心浸液培养基（BHIA）和万古霉素药敏纸片由英国Oxoid公司生产，E－test药敏板条由瑞典AB biodisk公司生产。
1.4 仪器 Vitek32微生物分析仪（法国，生物梅里埃公司）；Microscan WalkAWay－40微生物分析仪（美国，德灵公司）。
1.5 方法
1.5.1诱导方法 将试验菌株（10827）依次接种于4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml和64μg/ml的万古霉素MH培养基，每一个浓度传代3次，不同万古霉素浓度上生长的菌落分别命名为10827－4R、10827－8R、10827－16R和10827－32R。
1.5.2 菌谱分析 取金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 29213和10827及其诱导菌株采用直接菌悬液法配制到0.5麦氏浓度（细菌计数约为108CFU/ml）。以此菌悬液作连续10倍稀释，取每个浓度菌悬液100μl，分别划线接种到含万古霉素0～64μg/ml的梯度BHIA中，35℃孵育48h，进行菌落计数，并取菌落数lg对数作菌谱分析图。
1.5.3 CLSI/NCCLS推荐的筛选方法[1]将10827及其诱导菌株采用直接菌悬液法配制到0.5麦氏浓度，取10μl接种于含6μg/ml万古霉素的BHIA，接种面积直径为10～15 mm，35℃孵育，24h观察结果，有1个以上菌落或薄膜状生长判断为阳性，取生长的菌落重新鉴定，以保证为纯培养的金黄色葡萄球菌，同时用手工方法检测细菌的MIC，如MIC＝8～16μg/ml可报告为VISA，MIC≥32μg/ml可报告为VRSA。
1.5.4 Hiramatsu等[3]报道的筛选方法 菌液的准备和接种方法同1.5.3，筛选平板采用含4μg/ml万古霉素的BHIA。接种菌液量为10μl，35℃孵育，24h内有菌落生长，为可疑VISA，24～48h细菌生长，为可疑h－VRSA。挑取可疑菌落，进一步检测细菌的MIC以证实。
1.5.5 肉汤稀释法药敏试验 按NCCLS M7－A5所提供的方法配制系列万古霉素溶液，万古霉素系列倍比稀释浓度为0.12～256 μg/ml，每孔加100μl。取金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 29213和10827及其诱导菌株采用直接菌悬液法配制到0.5麦氏浓度，用肉汤将上述菌液进行1：100稀释（106CFU/ml），分别取100μl接种物，加入装有1ml万古霉素肉汤稀释液的各支试管和一支不含抗菌药物的生长质控管中，混匀，最终菌液浓度为5×105CFU/ml，35℃孵育，24h观察结果。
1.5.6 E－test法[4] 取金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 29213、10827及其诱导菌株采用直接菌悬液法配制到0.5麦氏浓度，均匀涂布接种于BHIA平板，待平板表面干燥，用镊子将E－test试条放在已经接种细菌的平板表面，并使试条全长与琼脂平板紧密接触，试条MIC刻度面向上，35℃孵育，分别于24h和48h后读取椭圆形抑菌环与E试条交界点的抑菌浓度（MIC值），同时观察抑菌环内有无菌落出现并对其分纯后重新鉴定。
1.5.7 纸片扩散法 取金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 25923、10827及其诱导菌株采用直接菌悬液法配制到0.5麦氏浓度，用无菌棉拭蘸取菌液均匀涂布接种于MH平板，待表面干燥，用无菌镊子将纸片贴于琼脂表面并轻压，使纸片与琼脂表面完全接触，35℃孵育，整24h观察结果。
1.5.8 仪器法 采用法国梅里埃公司的Vitek32和美国德灵公司的Microscan WalkAWay－40微生物分析仪分别对ATCC29213、10827及其诱导菌株进行药敏试验检测，操作方法按仪器说明书进行，结果由仪器自动判断。
2. 结果
2.1菌谱分析 10827为1株临床分离的金黄色葡萄球菌，表现为异质性耐药，即用肉汤稀释法检测MIC为2μg/ml，但在含4μg/ml万古霉素的BHIA上有细菌生长，该生长菌的MIC为8μg/ml。图1显示，随着万古霉素诱导浓度增加、诱导时间延长，曲线上抬、右移，由异质性耐药向同源性中介耐药和耐药发展。
2.2 药敏试验结果 表1所示，琼脂筛选方法、肉汤稀释法和E－test法可以有效地检测金黄色葡萄球菌对万古霉素的敏感性，但仪器法和纸片扩散法，则不能检测。
3. 讨论
不同检测方法对VISA的检测结果的差异，可能与以下因素有关：（1）检测时间：Marlowe等[5]发现VISA与万古霉素敏感的金黄色葡萄球菌（VSSA）比较，生长速度明显减慢，通常在18h内不出现肉眼可见的菌落，需要孵育整24h，甚至48h。而Vitek32对试验菌株药敏试验的平均报告时间为11h，Microscan WalkAWay－40的平均报告时间为13h。（2）VISA的易回复性：日本学者Cui等[6]将16株来自于世界各国的VISA菌株在不含万古霉素的培养基上连续传代，发现VISA易失去对万古霉素的耐药性，但仍然保留有对万古霉素异质性耐药的亚群。所以Cui等[6]提出h－VRSA可能是细菌在某些抗生素（如万古霉素、β－内酰胺类抗生素等）作用下诱导突变的结果，是稳定的；而VISA则可能是h－VRSA在万古霉素压力下选择性的结果，是不稳定的，一旦万古霉素选择性压力去除，VISA可回复为h－VRSA。（3）培养基的营养成分：Cui等[7]发现，VISA有明显的营养依赖性，他们认为VISA对万古霉素的耐药主要依赖增厚的细胞壁[10]，如果在培养基中加入丰富的细胞壁成分，如氨基酸和葡萄糖后，细菌的耐药性可以增加。本次试验表明，使用营养成分较高的BHIA检测效果较好。Cui等[7]报道如果在MH琼脂中加入20％的马血清，检测效果与使用BHIA相同。
前期的研究证明10827原代为h－VRSA菌株[2]，表1所示，该菌株仅可用含4μg/ml万古霉素BHIA检出。有关h－VRSA检测的意义目前尚有争论，但越来越多的学者[8]认为h－VRSA可能是VISA的前身。Takayama等[9]对1例心内膜炎患者使用万古霉素治疗不同时期分离的5株MRSA菌株进行药敏分析，结果显示，初次分离的MRSA菌株为h－VRSA，在万古霉素治疗过程中，耐药性逐渐增加，发展为VISA，并且最终导致治疗失败。图1所示，10827菌株在万古霉素选择性压力下，耐药性迅速增加，发展为VISA/VRSA，所以积极开展h－VRSA检测，对预防和控制VISA/VRSA的产生和传播有重要意义。
参考文献
1. Clinical and Laboratory Standard Institute /National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. fifteenth informational supplement[S]. Document M100－S15. NCCLS.2005.
2. 马筱玲，王敬华，李华，等. 异质性万古霉素耐药葡萄球菌分离及生物学特性观察．[J].中华微生物学和免疫学杂志，2004，24（7）：583－586.
3. Hiramatsu K，Aritaka N，Hanaki H，et al. Dissemination in Japanese hospitals of strains of staphylococcus aureus heterogeneously resistant to vancomycin .Lancet，1997，350（12）：1670－1673.
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5. Marlowe EM，Cohen MD，Hindler JF，et al. Practical strategies for detecting and confirming vancomycin－intermediate Staphylococcus aureus：a tertiary－care hospital laboratory’s experience，[J]. J Clin Microbiol. 2001，39（7）：2637－2639.
6. Cui LZ，Ma XX，Sato K，et al. Cell wall thickening is a common feature of vancomycin resistance in Staphylococcus aureus. [J]. J Clin Microbiol，2003，41（1）：5－14.
7. Cui LZ，Murakami H， Kuwahara－Arai K，et al. Contribution of a Thickened Cell Wall and Its Glutamine Nonamidated Component to the Vancomycin Resistance Expressed by Staphylococcus aureus Mu50. [J].Antimicrob Agents Chemother，2000，44（9）：2276－2285.
8. Ruef C. Epidemiology and Clinical Impact of Glycopeptide Resistance in Staphylococcus aureu. [J]. Infection 2004；32（6）：315–327
9. Takayama Y，Hanaki H，Irinoda K，et al. Investigation of methicillin－resistant Staphylococcus aureus showing reduced vancomycin susceptibility isolated from a patient with infective endocarditis.[J]. Int J Antimicrob Agent，2003，22 （6）：567－573.
10. 马筱玲. 万古霉素敏感性减低的金黄色葡萄球菌.[J]. 中华检验医学杂志，2004，27（9）：620－622.
