李金明
卫生部北京医院，卫生部临床检验中心，100730，北京
RNA病毒如丙型肝炎病毒（HCV）、人免疫缺陷病毒(HIV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）等的核酸检测对于感染的早期诊断和抗病毒治疗疗效的动态观察具有重要价值。自1983年发明聚合酶链反应（PCR）技术以来，出现了基因扩增的概念。目前多采用核酸扩增技术（NAT）来检测病毒RNA，最常用的是逆转录（RT）-PCR方法。核酸扩增检测要想得到可靠的结果，必须要使用质控品进行严格的质量控制，要对病毒进行定量测定，通常还须有病毒RNA标准品。目前RNA病毒扩增检测的质控品和标准品可分为两大类，一是裸露的RNA片段，二是内含特定RNA的病毒样颗粒或称之为带盔甲的RNA(armored RNA)。
一、裸露的RNA
裸露的RNA即没有任何蛋白包裹的RNA片段。其通常将特定的RNA病毒拟扩增RNA的 cDNA经体外转录的方式进行构建后，得到一种与相应cDNA互补的RNA（cRNA）。
cRNA的构建方法基本上是首先将所需的RNA逆转录为cDNA，再经PCR扩增后，产物DNA片段经T载体克隆入相应的质粒载体，然后再构建入含T7启动子的载体，体外逆转录得到相应的cRNA[1-5]。这种裸露的RNA即可用作为相应RNA RT-PCR测定的质控品和定量标准品。
裸露的RNA构建方法简单，可通过OD260nm波长下比色进行准确定量。其缺点是：（1）稳定性差，难于保存[1-3]。cRNA片段完全暴露于外界环境中，很容易被环境中的核糖核酸酶（RNase）所降解。（2）cRNA由相应模板DNA逆转录产生，原有模板DNA的“污染”很难通过加DNase消化去除[5]。（3）不能监测样本中RNA病毒颗粒的裂解效率。cRNA直接暴露于样本溶液中，无法模拟和监测真正的病毒颗粒的核酸提取过程[1-5]。由于上述原因，cRNA质控品和标准品很难在临床RNA病毒RT-PCR检测中实际应用，目前仅限于一些文献报道[1-5]。
二、内含特定RNA的病毒样颗粒或带盔甲的RNA(armored RNA)
已知某些RNA病毒如MS2噬菌体、烟草花叶病毒（TMV）的外壳可以耐受RNase的作用，因此，如将特定的RNA序列包裹到这些病毒外壳内，就可以使其免受环境中RNase的降解，同时，在应用过程中还可以模拟病毒颗粒监测核酸提取过程中的病毒裂解效率。
1．包裹于MS2噬菌体包膜蛋白内的RNA
MS2噬菌体属于正极性单链RNA球形病毒，基因组全长3569碱基对，编码成熟酶蛋白、包膜蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等四种蛋白质分子。噬菌体由180包膜蛋白单体、一分子成熟酶蛋白和一分子基因组RNA组成。在较早期的大肠杆菌病毒――MS2噬菌体包膜蛋白的研究中，发现包膜蛋白与操纵子RNA序列有特异性相互作用，这种作用可引发噬菌体外壳的组装，同时，将噬菌体基因组RNA包装到包膜内。因此，如果将特定病毒RNA的cDNA克隆于MS2噬菌体包膜蛋白基因序列cDNA下游，并在其下游插入终止子，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA序列的特定病毒RNA转录本，随后操纵子RNA序列就可以引发噬菌体包膜蛋白组装成外壳，并将携带有特定病毒RNA序列的部分噬菌体基因组包装到包膜内，构成噬菌体病毒样颗粒。在构建质粒表达载体时，需将噬菌体成熟酶蛋白、包膜蛋白基因序列cDNA克隆表达于表达载体启动子下游，经过诱导表达后，所表达的包膜蛋白不仅仅作为病毒样颗粒的结构成分，而且可作为基因表达调节因子和pac信号对表达过程进行调节，使包膜蛋白的表达和RNA的转录协调一致，组装所得噬菌体样颗粒具有成熟特性，从而具有RNase抗性[6-7]。
国外及我们的研究[8-13]将编码MS2噬菌体相应蛋白的cDNA序列连接到表达载体如pET28b T7启动子下游，经过诱导表达得到成熟酶蛋白和包膜蛋白，在成熟酶以及噬菌体基因组RNA片段的协同作用下，组装得到了耐RNase的病毒样颗粒。据此，我们成功构建了表达载体pI NCCL，并经原核表达后，得到的病毒样颗粒具有耐RNase的特性[12]。我们将HCV RNA[13]、HIV RNA和SARS-CoV RNA等的cDNA序列构建于该质粒载体中的MS2噬菌体1.9kb基因组下游，经转化细菌表达后，即可得到具有耐RNase的特性的内含特定RNA的病毒样颗粒。现我们亦已完成构建肿瘤标志物如前列腺特异抗原（PSA）和甲胎蛋白（AFP）的mRNA的病毒样颗粒的表达载体。由于pI NCCL表达载体的通用性，可以预见其在涉及RNA的标准品和质控品的研制中将具有极为广阔的应用前景。
2．包裹于烟草花叶病毒（TMV）包膜蛋白内的RNA
将特定的病毒RNA序列的cDNA与烟草花叶病毒（TMV）的包膜基因序列cDNA一起克隆连接到表达载体，诱导表达包膜蛋白并组装成病毒样颗粒。早已有报道说可以将外源基因插入植物病毒如TMV等病毒基因组中进行高水平表达[14]。在诱导表达过程中，外源基因表达产物随同组装的TMV颗粒一起组装到病毒颗粒内。在将外源基因序列克隆到病毒基因组的过程中，既要注意病毒基因组的组成又要注意引入外源基因序列的位点，这样可以确保病毒基因组可以引发包膜蛋白的组装，并且使组装成的颗粒具有成熟特性，即RNase抗性，同时，确保引入的外源基因序列不会在重组过程中发生丢失现象。
使用内含特定RNA的病毒样颗粒或带盔甲的RNA做为RNA病毒RT-PCR检测的质控品和标准品，具有下述几个方面的优点：（1）无生物传染危险性。（2）作为RNA RT-PCR检测的标准品和质控品具有很好的稳定性。（3）在核酸提取中，对病原体内RNA有很好的模拟作用。由于表达产物为噬菌体样颗粒，具有很好的病毒颗粒模拟功能，因此，在核酸提取过程中，与标本中真正病毒核酸的提取过程有很好的相似性。
此外，也有人应用牛腹泻病毒（BVDV）作为检测HCV的内部标准品[15]，或者用HCV病毒颗粒作为检测HCV RNA的标准品代替WHO提供的HCV标准品[16]，或者用HIV病毒颗粒作为通用的病毒RNA标准品，但是，这些技术无法克服病毒颗粒传染性、病毒颗粒制备运输困难等问题，也就是说病毒颗粒不是理想的标准品。
综上所述，在RNA病毒的RT-PCR检测中，影响实验过程的因素较多，如实验人员测定操作中的随机误差、扩增仪孔间温度的差异、标本核酸提取后抑制物的残留、待扩增靶核酸的浓度、逆转录的效率以及试剂的问题等，这些因素均可能会影响PCR扩增的效率，进而造成结果的偏差。因此，PCR测定必须使用质控品进行严格的室内质量控制才能保证结果的可靠性。此外，为进行定量测定，必须有定量的标准品或内标，内标还可以起到单管即时质控的作用。一个稳定可靠且无生物传染危险性的RNA质控品和标准品，对于保证RNA病毒的RT-PCR检测质量具有重要意义。在这一点上，裸露的RNA或病毒颗粒及病毒替代品均难以作为理想的质控品和标准品，而采用分子克隆和原核表达方法构建的内含特定病毒RNA片段的噬菌体病毒样颗粒则较好的解决了这些问题，其不但对于RNA病毒 RT-PCR检测的标准化，而且对于特定的mRNA的检测等均有着潜在的应用价值。
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