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荧光定量PCR检测血清和外周血单核细胞中HBV DNA含量及其意义 |
| [ 来源：本站 | 作者：杨晓静 邹雄 王立水 | 时间：2006-1-24 14:43:10 | 浏览： ] |
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杨晓静 邹雄 王立水
通过荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测慢性乙型肝炎及肝癌患者血清和外周
血单核细胞（PBMC）中乙型肝炎病毒（HBV）DNA含量，分析两者的相关性，阐述H
BV感染PBMC在乙型肝炎慢性化和向肝癌恶性转化中的作用。
1. 资料与方法：
(1)研究对象：慢性乙型肝炎患者36例，年龄17～55岁，平均31.2岁；乙型肝
炎后肝癌患者15例，年龄34～68岁，平均47.6岁。诊断依据文献。选择本院职工和
健康查体者20例作为正常对照，年龄21～50岁，平均31.5岁。(2)方法: 用淋巴细
胞分离液分离PBMC，pH7.2 PBS 10ml洗涤5次，以去除残留的血浆HBV DNA，收集末
次洗液（500μl）及细胞，调整细胞浓度至2×109/L，取100μl细胞悬液加等量细
胞裂解液反应20min，显微镜观察证实细胞完全裂解。100μl血清、洗液或PBMC裂
解液常规碱裂解法提取HBV DNA，在Bio-Rad iCycler自动荧光PCR检测仪上测定，
由计算机软件分析计算定量结果。试验的灵敏度为103 拷贝/ml，病例均以<103 拷
贝/ml为阴性结果。为便于统计，以检测结果绝对值的对数值进行比较。(3)统计处
理：使用SPSS10.0统计软件行t检验和χ2检验。
2. 结果：
慢性乙型肝炎和肝癌患者血清HBV DNA阳性率分别为44.44%（16/36）和60.00
%（9/15），阳性标本HBV DNA含量对数值分别为5.25±1.25和5.71±1.31，两者比
较差异无显著性。肝癌患者PBMC HBV DNA阳性率为80.00%（12/15）高于慢性乙型
肝炎患者47.22%（17/36）（χ2＝4.64，P＜0.05），两者间HBV DNA含量对数值（
4.62±1.13与4.05±0.91）差异无显著性（t＝1.90，P＞0.05）。慢性乙型肝炎和
肝癌患者血清HBV DNA总阳性率为49.02%(25/51)，和PBMC内HBV DNA总阳性率56.8
6%(29/51)相近。血清和PBMC HBV DNA均为阳性的患者占全部病例的47.06%（24/5
1），均为阴性的患者占41.18%（21/51），血清和PBMC检测结果一致的患者占88.
24%（45/51），两者差异有相关性（χ2＝30.62，P＜0.01）。慢性乙型肝炎患者
中PBMC内HBV DNA（+）而血清HBV DNA（－）的占5.56%（2/36），肝癌患者中PBM
C内HBV DNA（+）而血清HBV DNA（－）的占20.00%（3/15），两者差异无显著性(
χ2＝1.13，P＞0.05)。血清和PBMC HBV DNA均为阳性的15例慢性乙型肝炎和9例肝
癌患者血清和PBMC HBV DNA含量对数值间均呈正相关，相关系数分别是0.9477和0
.9506，t值分别为10.71、8.10，P值均＜0.01。正常对照组血清和PBMC标本HBV D
NA均为阴性，提取PBMC的末次洗液HBV DNA均为阴性。
3. 讨论
荧光定量PCR（FQ-PCR）技术融汇PCR和荧光探针杂交技术的优点，直接探测P
CR过程中荧光信号的变化，根据PCR反应的酶动力学特点，获得DNA模板的准确定量
结果。血清HBV DNA检测对HBV暂不释放入血的肝内外感染不易检出，有一定的局限
性。而肝组织HBV DNA的检测必须借助于肝穿刺获得标本，限制了其常规应用。所
以对许多暂不具备开展肝穿刺条件者，通过PBMC HBV DNA的检测能间接反映肝细胞
内HBV DNA的存在情况，从而对慢性乙型肝炎患者HBV的复制状态有更准确的评价。
慢性乙型肝炎和肝癌患者中HBV感染PBMC的情况较为常见，肝癌患者PBMC HBV DNA
阳性率显著高于慢性乙型肝炎患者，PBMC和血清HBV DNA阳性率间有相关性，血清
和PBMC HBV DNA含量对数值间呈高度正相关，说明在慢性乙型肝炎和肝癌患者中，
PBMC和血清中HBV DNA的变化呈一致性趋势。慢性乙型肝炎和肝癌中尚存在血清HB
V DNA阴性而PBMC HBV DNA阳性的患者，两组间的差异虽无统计学意义，但肝癌组
有增高趋势。PBMC HBV DNA阳性的患者其血清HBV DNA阴性，可能是这类患者体内
病毒复制正处于低谷期，血清中HBV量很低，病毒多隐匿于细胞中。一方面，隐匿
于PBMC中的HBV作为潜在的传染源，引起病毒重复感染和肝脏病变反复活动；另一
方面，HBV长期存在于PBMC和肝细胞中，增加了HBV的整合机会，这可能是肝癌发生
发展的高危因素。PBMC HBV DNA的检测是对血清HBV DNA检测的重要补充，HBV感染
PBMC可能在乙型肝炎的慢性持续及向肝癌的恶性转化中起重要作用。
中华肝脏病杂志
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原始作者： 杨晓静 邹雄 王立水 |
录入时间： 2006-1-24 14:43:10 |
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