作者单位：150001 哈尔滨，哈尔滨医科大学附属第一临床医学院遗传与不育诊疗中心
[摘要] 目的 Y染色体的AZF缺失是造成男性无精、少精的重要因素，通过PCR方法可以从基因水平检测病人的病因。方法 采患者外周血提取DNA，经PCR扩增后，采用100bp的分子量标准，产物进行聚丙烯酰氨凝胶垂直电泳。结果 经PCR方法检测15例经确诊为无精、少精症患者的Y染色体微小缺失，有1例缺失SY87、SY143、DAZ三条带，2例缺失DAZ带。 结论 用PCR方法可以检测AZF的缺失，是一种有效而可靠的检测方法，适用于男性无精、少精症患者的诊断。
[关键词]Y染色体微小缺失；PCR；无精、少精症
DETECT THE MICRODELETION ON Y-CHROMOSOME OF OLIGOZOOSPERMIA MALE BY PCR Chang Dong, Qu Yingbo, Liu Rui, Sun LingDi (department of GIVF in Joint Venture China-USA Center of the first afflicted hospital of Harbin Medical University, Harbin， 150001 China)
[abstract] Objective The deletion of azoospermia factor gene is a very important factor to result in men with oligozoospermia or azoospermia. It is can be detected by PCR from gene level. Methods Extract DNA from the patients’ peripheral blood. We use 100bp molecular weight ladder. The productions of PCR process polyacrylamide gels vertical electrophoresis. Results We detect 15 cases patients who were diagnosis oligozoospermia by PCR technique. One patient miss all three bands: SY87、SY143、DAZ. Two patients both miss DAZ band. Conclusion Detect the deletions of AZF by PCR is an efficient and reliable technique. It is suitable to diagnosis the oligozoospermia and azoospermia.
[Key words] microdeletions of Y-chromosome; PCR; oligozoospermia; azoospermia
在男女不孕不育症中，男性不育的因素约占40%。有文献报道：90%的男性不育症是由于生精功能障碍引起的，其中特发性生精障碍占60%，半数以上属原因不明者[1]。而Y染色体正常与否起着至关重要的作用，因此研究Y染色体的相关基因有重要的临床价值。
在少精症和无精症的男性患者中，Y染色体微缺失占20.5%，据对Y染色体遗传序列的研究证实，Y染色体上微缺失是引起男子不育的主要原因之一。Tiepolo和Zuffardi等于1979年发现在Yq11上存在着“无精子因子”（azoospermia factor, AZF）[2]，它决定男性的精子生成。经实验证实，约13%的非梗阻性的少精或无精症患者是由于Y染色体长臂上的AZF缺失造成[3]，而随机选择的有生育能力的男子未见此缺失。这些缺失位于AZFa、AZFb, AZFc区域[3]（如图1所示），这些区域中含有很多基因，我们设计了一个实验，通过对每个区域接近中心的位点进行一次PCR扩增来研究三个AZF区的缺失情况。
1 对象与方法
1.1 对 象
15例经查无精或少精的男性不育患者的外周血样本，并且经细胞遗传学检查Ｙ染色体无明显缺失。患者均为2002年6月至2003年6月因不育来本院男科就诊的患者，年龄在26～36岁之间。按照国际标准，无精症为精液中无精子；少精症为精子总数＜4000万或＜2000万/ml。正常人对照2名，男、女各1名，均有正常孕产史，年龄在26～36岁之间。
1.2 方 法
1.2.1 DNA的提取 抽取2ml静脉全血，置于EDTA-K3抗凝的真空采血管中，使用Gentra公司生产的puregeneDNA提取试剂盒，按照操作说明提取DNA。
1.2.2 PCR引物 在AZFa区域，检测SY87基因；在 AZFb区域，检测SY143基因；在 AZFc区域，检测精子缺乏基因（azoospermia，DAZ）的外显子2。所有检测可以在同一管内完成，同时选用染色体上男女共有的基因RhE作为对照。引物序列由美国遗传与不育诊疗中心提供，由上海生工生物工程公司合成。AZFa、AZFb、AZFc三个区域在Y染色体上的位置如图1所示。
1.2.3 PCR扩增 ①设置正常男性、女性和空白对照。②PCR反应体系24μl中含有双蒸水、dNTP、10xPCR缓冲液、引物、Taq酶、模板。③PCR扩增程序为：94℃预变性8分钟；然后94℃1分钟，50℃1分钟，72℃1分钟，共循环32次，之后冷却至15℃10分钟。放室温至电泳。④电泳检测。配制12%聚丙烯酰氨凝胶，垂直电泳。每管反应物中加入2μl溴酚蓝，充分混合。取10μl加于胶孔中，同时加100bp分子量标准，染胶5分钟，在透射式紫外灯下观察结果。
2 结 果
15例患者的外周血标本经外周血细胞培养，G显带染色体分析均未见异常。
12%聚丙烯酰氨凝胶垂直点泳，正常男性对照有SY87、SY143、DAZ、RhE四条带，正常女性对照只有RhE一条带，空白对照没有带。经实验测定，在15例患者中，有2例患者DAZ带缺失，1例患者缺失SY87、SY143、DAZ三条带。结果如图2、3所示。
3 讨 论
根据文献报道，Y染色体的微缺失发生率为1%～55.5%，其中非梗阻性的无精症患者平均为12%，严重少精症患者为6%[4-7]。发生率数值变化这么大，原因之一是各个实验室对患者的筛选标准不一致。另一个可能的原因是各个实验室所选择的目标序列（sequence tagged site，STS）及其数目不同。有的研究人员只选用一个位点，有的研究人员选用多个位点进行筛选[8]。根据相关资料，本研究选择三个AZF区域的接近中心的位点进行实验，既可以检出造成生精障碍的患者，又避免了不必要的浪费。最新研究发现，在ＡＺＦｂ和ＡＺＦｃ之间又增加了一个ＡＺＦｄ区域〔９〕。
Y染色体由于含重复序列的长区域，所以容易缺失。目前关于Yq的缺失可以引起精子生成异常有两种假设。一种假设认为，精子生成障碍完全由AZF区域所单独决定，每个患者症状的轻重由AZF区域所缺失的某一个或某几个基因而决定。在这一假设中，AZF区必须由至少两个精子生成基因构成。根据这种假设，精子生成能力下降的严重程度与Y染色体的缺失程度成正比。另一种假设认为，在环境、随机因素或AZF区域之外的其他基因的共同作用下，使AZF的缺失具有临床意义。由于我们所做的病例不多，还不能推断哪一种假设更切合实际[10]。
AZF可能是一个单一基因，也可能是多个基因，它编码的蛋白质迄今为止还是未知的。目前认为编码RNA结合蛋白的DAZ基因是AZF的功能基因[11]。在我们所检测的少精症患者中，凡Y染色体微缺失者，都表现了DAZ基因的缺失。如果DAZ缺失是造成男性少精症的原因，那么DAZ的点突变也能造成少精症。
这项检测对于因为男性患少精症而进行辅助生育的夫妇有重要意义。因为通过卵泡浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）技术可使少精症患者的妻子受孕，如果这位患者罹患了Y染色体微小缺失，那么他通过ICSI技术得到的男性后代一定同样是Y染色体微小缺失的患者。因此，在实施辅助生育技术之前，对有适应症的患者进行这项检查有重要意义。
参考文献
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[9]肖晓素,刘晓,王勇强 等. Ｙ染色体ＡＺＦ区域微缺失的细胞遗传学和分子遗传学研究. 中华医学遗传学杂志,2004，21（3）：267.
[10]Renee Reijo, Raaji K Alagappan, Pasquale Patrizio, et al. Severe oligozoospermia resulting from deletions of azoospermia factor gene on Y chromosome. The Lancet,1996, 347(11):1290-1293.
[11]Reijo R, Lee T-Y, Salo P, et al. Diverse spermatogenic defects in humans caused by Y chromosome deletions encompassing a novel RNA-binding protein gene. Nature Genet,1995,10:383-93.
