作者单位：215006 苏州，苏州大学附属第一医院 江苏省血液研究所（钱军，现就职于江苏大学附属人民医院）
【摘要】 目的 应用cDNA微阵列初步研究骨髓增生异常综合征（MDS）的基因表达谱。方法 将2例患者骨髓单个核细胞RNA各取等量混合后进行逆转录Cy5标记，与Cy3标记的正常对照cDNA混合，与H141微阵列杂交、扫描、软件分析。 结果 H141s芯片中共点样13 484个基因克隆，其中1 064个靶克隆是由针对同一基因内不同序列的cDNA片段重复点样至少2次。重复点样检测结果在2张芯片内各自完全一致的分别为625个（58.7％）和630个（59.2％），而在结果完全相反的cDNA片段分别有21个（2.0％）和11个（1.0％）。1 064个靶克隆中重复点样数据完整且分别在2张芯片内结果一致的共有411个，其中在2张芯片间结果也完全一致的共有400个（97.3％）。2张芯片中MDS与正常对照比较存在差异表达的靶基因克隆分别为1 549和1 311个，而2张芯片间表达差异一致的靶基因克隆为409个，其中101个基因参与造血调控，主要涉及转录因子、细胞周期调节蛋白、代谢相关基因、表面黏附分子等。结论 重复克隆点样实验可降低微阵列操作过程引起的表达偏差。cDNA微阵列可高效提供基因表达信息，并为深入研究MDS的发病分子机制提供线索。
【关键词】 骨髓增生异常综合征；cDNA微阵列；基因表达谱
Preliminary study on the gene expression profiles of mononuclear cells from myelodysplastic bone marrow by using cDNA microarray
QIAN Jun, CHEN Zixing, CEN Jiannong, WANG Wei. Leukemia Research Unit, The First Affiliated Hospital, Soochow University, Jiangsu Institute of Hematology, Suzhou 215006, China
【Abstract】 Objective To study the gene expression profiles of mononuclear cells from myelodysplastic bone marrow by using cDNA microarray. Methods Total RNAs of equal quantity from mononuclear cells in bone marrows of 2 case of myelodysplastic syndrome (MDS) were blended, reversely transcribed to cDNA and labeled with Cy5. Cy5-labeled cDNA and Cy3-labeled cDNA from normal bone marrow cells were hybridized to H141 microarray in duplicate. Analysis was performed on the scanning data. Results There were 13484 clones in H141 chips, in which 1064 cDNAs were spotted at least twice targeting different fragments of a single gene. Among these 1064 genes, the expression level of 625 (58.7％) and 630 (59.2％) clones was consistent within two respective chips, 297 (27.9％) and 191 (18.0％) inconsistent, 21 (2.0％) and 11 (1.0％) opposite. Among 411 duplicately spotted cDNAs with complete data, expression levels of 409 (97.3%) were consistent between two chips. 101 genes involve in hematopoiesis regulation, including transcription factors, cell cycle-regulating proteins, metabolism-relating genes, and adhesive molecules. Conclusion Replication can reduce the data bias caused by experimental operation. cDNA microarray analysis is highly effective for profiling gene expression pattern of MDS and provides new clues for the further exploration of its molecular pathogenesis.
【Key words】 Myelodysplastic Syndrome; cDNA Microarray; gene expression profile
骨髓增生异常综合征（MDS）是一组起源于造血干/祖细胞的克隆性疾病，患者表现为外周血细胞减少、骨髓增生活跃或明显活跃伴病态造血，向白血病进展的风险增高。已知多个基因的异常改变在MDS的发生、发展中起着重要作用，如ras、p53、c-fms、肿瘤坏死因子（TNF）等，目前研究陆续发现有新的基因参与该过程[1]，但迄今未能确定何种基因异常在MDS的发病中起决定作用。这与以往的常规研究方法所分析的基因谱甚为狭窄有关。cDNA微阵列（microarray）的问世为研究人类肿瘤的基因表达模式、揭示各类肿瘤的分子生物学特征及临床相关性提供了高通量快速检测平台[2]。但微阵列分析所需的标本量较大，总RNA需达20～200μg，而MDS患者因抽吸骨髓中细胞数较少，往往难以达到检测所需要求，一个解决办法是进行mRNA扩增[3]，但任何扩增方法都可能使mRNA的真实分布模式发生改变，尤其是指数扩增法[3,4]。我们尝试通过将不同患者的标本混合后进行重复cDNA芯片杂交，以减少对mRNA的需求量并降低假阳性率，进而评估微阵列技术在MDS研究应用中的可行性。
1 病例和方法
1.1 病例资料
2例均为我院门诊患者，根据FAB分型为难治性贫血（RA）1例、RA伴环形铁粒幼细胞增多（RAS）1例；2例患者均为男性，分别为58岁和60岁。RA患者血常规三系减少、骨髓增生明显活跃，红系比例增多达37.5％，可见H-J小体，核型分析结果为46,XY,20q-[8]/46,XY[N]；RAS患者表现为单纯贫血，骨髓增生明显活跃，可见类巨幼红和双核小巨核细胞、环形铁粒幼细胞36％，核型正常。
1.2 骨髓单个核细胞（MNC）分离和RNA制备
每例患者于初诊时各取肝素抗凝骨髓10ml，用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，应用TRIzol一步法提取总RNA，所提取的RNA电泳均可见清晰的28s及18s两条带，经分光光度计检测质量分别为45.36μg和53.4μg。正常骨髓取自血常规正常的15例胸外科肿瘤患者的肋骨。
1.3 探针标记与杂交、分析
详细方法见博星基因芯片公司实验操作流程说明。简要步骤如下：2例标本总RNA各取45μg，混合后进行逆转录合成cDNA，在逆转录过程中同时进行荧光素Cy5-dUTP标记；正常对照取90μg进行荧光素Cy3-dUTP标记。cDNA芯片（H141s，上海博星基因芯片公司）含有13 484个靶基因，病例探针和正常探针混合变性后分为2等份分别与2张芯片杂交。ScanArray3000（GSI Lumonics, Bellerca, Mass, USA）扫描芯片，GenePix Pro3.0软件（BioDiscovery, Los Angeles, Calif., USA）分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值，并对Cy3荧光强度进行均一化，如均一化后的Cy5/Cy3比值大于2或小于0.5则显示病例与正常对照的mRNA存在表达差异。
2 结 果
2.1 芯片的有效数据
Cy3、Cy5值两者皆大于200或其一大于800时该点荧光强度视为有效数据，2张芯片的有效数据分别为7 986（56.6％）和7 429（51.9％）个，其余数据因信号太弱(一对信号皆低于200)、杂质或背景干扰而被排除。
2.2 芯片的重复性
H141s芯片中共有1 064个靶克隆是由针对同一基因内不同序列的cDNA片段重复点样至少2次（2～7次）。重复点样检测结果在2张芯片内各自完全一致的分别为625个（58.7％）和630个（59.2％），有一个点不一致的为297个（27.9％）和191个（18.0％），而存在完全相反结果的cDNA片段分别有21个（2.0％）和11个（1.0％）；至少有1个数据因信号太弱、杂质或背景干扰而被排除的cDNA片段分别为121（11.2％）和232个（21.8％）。如以Cy5/Cy3比值相差3倍以上判为待测MDS细胞与正常对照细胞之间表达差异，则在2张芯片内结果各自完全一致的分别为815个（76.6％）和759个（71.3％），2张芯片之间对应位置点检测结果完全相同的为783个（73.6％）cDNA片段，有一个数据不同的为254个（23.9％）cDNA片段，而数据完全不同的有27个（2.5％）。1 064个靶克隆中重复点样数据完整且分别在2张芯片内结果一致的共有411个，其中在2张芯片间结果也完全一致的共有400个（97.3％）。
2.3 MDS患者基因表达谱特征
2张芯片中存在表达差异的靶克隆分别为1 549和1 311个，而2张芯片中具有一致性表达差异的靶克隆仅为409个，含功能已知的基因252个，主要涉及转录因子、细胞周期调节蛋白、代谢相关基因、细胞骨架蛋白等。表达下调的基因有158个，与造血调控相关的有42个，如造血细胞表达的同源盒（HHEX）、干扰素相关发育调节因子（IFRD1）、CD164、核心结合因子β亚单位（CBFβ）等；表达上调的基因为94个，可能参与造血调控的有16个，如thrombospondin 1（THBS1）、金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP1）、CD163、ETV1等。此外，取2张芯片中结果不一致的Cy5/Cy3比率均值，均值大于2或小于0.5的有598个，仅4个（0.7％）基因在2张芯片中比值呈完全相反的改变；余594个基因含功能已知的236个，其中43个基因与造血调控有关，22个表达下调如CD123/IL3Rα、L选择素（CD62L）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱骗受体2（TRAIL-R4，DcR2），21个表达上调如TRAIL、IFNα受体Ⅰ型（IFNAR1）、造血蛋白1（HEM1）等。表1为MDS中存在表达差异的部分基因。
3 讨 论
MDS代表着从正常造血干/祖细胞克隆恶性转化成白血病细胞的一个动态过程，在该过程的各个阶段中细胞群体的组成都具有极大的异质性，并且随着病情的演进，这种异质性的细胞成分还在不断地消长变化。因此，对于任一阶段的MDS异常细胞群体其生物学和遗传学特征都极其复杂，可能涉及多种基因的变化，导致仅从单基因水平研究其发病和进展机制变得极其困难，因而需要高通量的检测技术对之进行分析。而cDNA微阵列以其高通量提供巨大信息量的强大功能为揭示MDS发生、发展的潜在基因表达异常提供了强有力的武器。
MDS患者虽然骨髓内呈增殖活跃甚至明显活跃状态，但同时伴随着过度凋亡，导致外周血细胞减少。而抽吸骨髓量较多时必然会发生血液稀释，导致实际分离出的单个核细胞数量少，难以满足cDNA微阵列分析的需要。因此，Hoffmann[5]运用双重扩增技术对有限的CD34+细胞的RNA进行扩增，然后再对其表达谱特征进行分析，但进一步应用实时定量PCR（real-time PCR）验证时发现荧光强度在1 000内的7个基因仅3个（43％）与芯片结果相符。我们的初步研究也证实目前芯片实验的重复性并不理想，需要进行重复以去除芯片操作如逆转录、标记、杂交、洗涤、扫描等过程引起的表达偏差[6]；同时我们应用2例MDS早期阶段（RA和RAS）样本进行混合以去除各自的个体差异，更便于筛选出与MDS早期阶段发病相关的共同基因改变，结果将存在表达差异的基因范围进一步缩小，利于今后定制芯片对MDS致病相关基因进行进一步研究。
TRAIL是TNF超家族中的一个新成员，与TNF和FasL一样，通过与死亡受体DR4和DR5及诱骗受体DcR1和DcR2结合发挥不同的凋亡诱导或抑制作用。最近Zang等[7]的研究揭示在MDS患者骨髓单个核细胞和CD34+细胞中TRAIL的表达明显增高；我们的芯片初步结果也证实MDS患者TRAIL表达增高，同时DcR2表达下降、对凋亡的抑制作用降低，提示TRAIL信号传导途径异常可能在MDS无效造血的发生中起着一定作用。此外，我们还发现一些新的造血调控基因在MDS中可能存在着异常表达，例如最近发现的一个细胞表面糖蛋白CD164能介导造血干/祖细胞与骨髓基质的黏附、并抑制造血干/祖细胞进入细胞周期[8,9]，而我们发现CD164在MDS中表达下降，但是否与造血细胞过度增殖有关还有待于进一步研究。转录因子CBF家族在正常造血发育中发挥着重要的调控作用；累及CBFα或CBFβ的染色体重排可见于约30％的急性髓性白血病患者，其结果导致CBFα/β复合物形成障碍，进而使IL3、GM-CSF和M-CSF受体等造血相关基因的表达发生异常[10,11]；但其自身表达水平的改变与白血病的相关性目前尚不明确。
我们的研究结果初步证实微阵列技术能够高效地提供MDS丰富的基因表达信息，可以为深入研究MDS发病和病程进展的分子机制提供线索；我们已将初步筛选出的差异表达基因进行芯片定制，下一步将对更多MDS病例的表达谱改变进行研究。
参考文献
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