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关琪1，邢辉2，李鲁平3黄海龙2，魏民2，洪坤学2，张卓然3，邵一鸣2
[摘要] 目的 研究我国人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）B’亚型主要流行株在宿主免疫压力下抗原表
基金项目：1999年度国家杰出青年科学基金资助项目（39925030），国家重点基础研究发展规则项目（G1999054107）
作者单位：1. 110024 沈阳，沈阳医学院附属中心医院检验科（关琪）； 2. 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防与控制中心病毒免疫室（邢辉、黄海龙、魏民、洪坤学、邵一鸣）。3.大连医科大学基础医学院微生物学教研室（李鲁平、张卓然）。
作者简介：关琪（1969-），男，辽宁沈阳人，副主任检验师，硕士，主要从事抗病毒免疫方面的研究。
位的变异特征。方法 从确诊的HIV-1感染者的全血样本中提取基因组DNA，经套式聚合酶链反应（PCR）扩增后，将扩增产物进行纯化和测序。然后将所得病毒核苷酸序列翻译成蛋白质的氨基酸序列，比较和分析我国人群中较常见的HLA型别限制的CTL表位的突变情况。结果 在本研究所观察的7个抗原表位中，抗原表位的保守率均随时间的推移而下降，且大部分表位的变化相当明显。结论 我国HIV-1 B’亚型毒株抗原表位的变异在逐渐加大。
[主题词] 人类免疫缺陷病毒1型；序列；B’亚型；抗原表位
Analysis of variation of antigen epitopes in GAG protein of HIV-1
subtype B′viruses prevalent in China
GUAN Qi (Central hospital affiliated to SHEN YANG medical college ); XING Hui, HUANG Hai-long, WEI Min, HONG Kun-xue, SHAO Yi-ming.（National center for AIDS/STD prevention and control, Chinese center for disease prevention and control.）
【Abstract】 Objective To study the characteristics of variation of antigen epitopes of HIV-1 subtype B′viruses prevalent in China under the host immune pressures. Methods Genomic DNA was extracted from the whole blood samples collected from HIV-1 positive patient. Nested PCR were carried out and PCR products were purified and used directly for sequencing. After translated into amino acid sequences, The analysis of variation of CTL antigen epitopes restricted by main HLA specificities in our country was performed. Results. Conservation of HIV GAG epitopes decreases by the time. Conclusions Variations of antigen epitopes of HIV-1 subtype B′viruses prevalent in China are increasing by the time.
【Key words】HIV-1; B′subtype; nested-PCR; antigen epitope.
在HIV-1感染者体内针对病毒病原体产生特异性免疫应答的过程中，病毒自身所携带的抗原表位是机体免疫系统直接作用的靶点，对激活机体免疫应答起着至关重要的作用。但HIV的抗原表位并非一成不变，而是在宿主免疫压力下不断地发生着各种各样的变化，这种变化正是HIV-1病毒逃避机体免疫监视的重要机制之一。本文试从抗原表位的角度对我国HIV-1 B’亚型毒株gag基因的变异进行分析，以期获得的抗原表位变化的数据资料可以为我国HIV-1 B’亚型疫苗的研制提供指导。
1 材料和方法
1.1 标本来源
标本为国内2次HIV-1分子流行病学调查中确诊的阳性新鲜抗凝全血标本，采用德国QiaGen 公司试剂盒（QIAamp Blood Mini Kit）从中提取细胞基因组DNA，使用紫外分光光度计检测核酸最终浓度大约为0.05～0.2g/L，然后对其HIV-1 gag基因进行扩增和测序。总计256份标本。感染途径分别为：献受血、吸毒和性途径。
1.2 HIV-1 gag基因的扩增
用nested-PCR对HIV-1 P17/P24交界区的400bp长 gag 基因片段进行扩增，实验所使用的仪器设备、扩增引物序列及其PCR反应条件详见参考文献[1-3]。
1.3 产物纯化和测序
将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后，与DNA标准品（Marker）对照判断无误后，切下特异性扩增带，用德国QiaGen公司的Gel Extraction Kit试剂，按说明书提纯扩增的gag基因p17/p24区段。回收得到的DNA溶于双蒸水中。将纯化后的PCR产物，以306为测序引物完成测序反应并进行基因测序分析。
1.4 结果分析
经PCR扩增和测序共得到我国HIV-1 B’亚型gag蛋白P17/P24区段序列223条，将这些序列用ABI公司的SeqED软件进行编辑和校正，使用Wisconsin Package GCG(Version 10.0)软件进行分析。以Pileup和Clustal X等软件对我国HIV-1 B’亚型病毒gag序列与各国际、国内参考株序列进行排列和比较，国际参考序列和HIV-1 B’亚型病毒CTL 抗原表位的构成和分布资料从美国Los Alamos网站上的专业HIV核酸序列库（HIV Databases）[4]下载得到；使用Translation程序将核苷酸序列翻译成蛋白质的氨基酸序列，并经Pretty程序做出共享序列（consensus）。统计并分析我国HIV-1 B’亚型毒株gag蛋白部分区段的抗原表位的变化。
2 实验结果
将2000～2001年采自河南、江苏、江西、山西4个省的15份样本的基因序列与2份国际参考序列（b.fr.hxb2；b.cn.rl42）排列在一起做成共享序列（见图1）。通过与2002－2003年度的56份HIV B’亚型序列[3]进行比较发现，在22位上的氨基酸发生了变化。前者以L为主（L:60%；R:40%），后者以R为主（92.86％），其变化较为明显。另外，图1中两条短横线所示为gag蛋白的两个糖基化位点，均为“N-x-S”型。
图1. 2000－2001年度国内HIV B亚型毒株氨基酸共享序列
本文根据我国人群HLA-I类基因常见的分布型别[5,6]和目前已确认的HIV-1 GAG蛋白的抗原表位的分布情况[4]，对我国HIV-1流行株CTL抗原表位的变化进行了分析。通过对2000－2001年采集的15份样本和2002－2003年采集的56份（从208份样本序列中随机挑选）样本[3]的7个HIV-1 CTL抗原表位（其中HLA-A限制的抗原表位5个；HLA-B限制的抗原表位2个）的变异情况进行统计，分析我国HIV-1 B’亚型毒株的CTL抗原表位在宿主免疫压力下所发生的变异情况，结果见表1和参考文献[3]。通过两个不同年份抗原表位变化的比较可见，所研究的各表位的保守率（即与已确认的抗原表位完全相同的毒株占全部毒株的百分比）均随时间发生了不同程度的下降（除“NYPIVQNI”表位外均具有统计学意义）。
表1 HIV B亚型GAG区段主要HLA限制的CTL抗原表位情况
HLA分类 位置 表位氨基酸组成 我国毒株的突变 完全相同的样本数 与我国突变相同的样本数 完全相同表位的百分比（％）
2000年 2002年 2000年 2002年 2000年 2002年
HLA-A2 P17:77-85 SLYNTVATL Y3F 3 3 9 18 20.0 5.36
HLA-A11 P17:84-92 TLYCVHQRI 无 11 15 73.3 26.78
HLA-A11 P17:84-91 TLYCVHQR 无 11 16 73.3 28.57
HLA-A11 P17:82-91 VATLYCVHQR 无 11 13 73.3 23.21
HLA-A24 P17-P24 NYPIVQNI I8L 1 3 14 49 6.6 5.36
HLA-B60 P17:93-101 EIKDTKEAL 无 11 30 73.3 53.57
HLA-B60 P17:92-101 IEIKDTKEAL 无 11 29 73.3 51.78
3 讨 论
在本实验所研究的基因区段内对中国HIV B’亚型毒株序列进行糖基化位点的扫描，发现在我国HIV-1 B’亚型毒株共享序列中存在73位和90位（对应HXB2的位置为109和122）氨基酸位置的两个糖基化位点，均为“N-x-S”型。在2000～2001年的15份样本中，73位糖基化位点的丢失率为20％；90位糖基化位点的丢失率为6.67％。在2002～2003年的56份样本中73位糖基化位点丢失率为7.14％；90位氨基酸位置糖基化位点丢失率为17.86％。糖基化位点的糖基化，可以有效的覆盖HIV的抗原表位，造成该处抗原表位不能正常暴露于分子表面，进而失去刺激机体免疫应答的能力，而使HIV可以逃避机体的免疫监视[7]。同时，糖基化位点的丢失将促使一些原本无应答的抗原表位得以呈现，以供免疫识别。由此可见，本实验中相距十几个氨基酸位置的两个糖基化位点随时间发生了不同程度的变化，这种变化很可能导致邻近位置的抗原表位随之而发生改变，进而造成病毒免疫原性的变化。所以，在疫苗的设计中应对糖基化位点变化对抗原表位的影响予以充分考虑。
将我国B’亚型病毒的共享序列和国际B亚型的共享序列进行比较，发现4个位点截然不同。为26位（我国为E，国际株为G）；43位（我国为F，国际株为Y）；93位（我国为N，国际株为S）和114位（我国为P，国际株为A）。此4个位点为我国B’亚型毒株在GAG基因P17与P24交界区的特征性位点。
本文对我国HIV B’亚型毒株CTL抗原表位的变化情况进行了分析，发现在所研究的我国主要HLA限制的gag区段的7个CTL抗原表位中，与我国HIV-1 B’亚型共享序列相比，有5个没有发生点突变，比例为71.4％。在另外2个有点突变的表位中，HLA-A24限制的位于P17与P24交界处的“NYPIVQNI”抗原表位的第八位锚着位点由L变为I，但其仍可作为锚着位点而被HLA-A24分子选择性的呈递。另外一个发生点突变的抗原表位的突变点并未发生在锚着位置，所以推断这种突变对该抗原表位呈递的影响不会很大[8,9]。
从2000～2001年和2002～2003年两个不同时间段我国HIV B’亚型毒株gag区抗原表位的变化情况可以看出，在本研究所观察的7个抗原表位中，抗原表位的保守率均随时间的推移而下降，且大部分表位的变化相当明显，只有位于P17与P24交界处的抗原表位“NYPIVQNI”的保守率变化不大，这可能是由于该表位位于P17与P24两个蛋白的交界处，其本身即为蛋白酶的酶切位点识别部位，该部位的变化将极大的影响到蛋白酶的识别，进而使HIV不能组装成成熟的病毒颗粒，而导致病毒死亡，因而该位点的变异受到了很大程度的限制。从上述抗原表位保守率变化的结果可见，在机体免疫压力的作用下，HIV病毒为了躲避机体强大的免疫选择压力，不得不使自身的基因序列不断的产生突变，进而使原有的抗原表位不断的发生变化，使机体原本建立起来的针对变异前抗原表位的免疫应答不再识别经变异产生的新的抗原表位，从而使HIV病毒能够逃避机体的免疫监视而一代代的繁衍下去。
本研究提示，我国HIV-1 B’亚型病毒的抗原表位的变异呈现不断加大的趋势，这为我国HIV-1 B’亚型病毒所引起的艾滋病的预防和控制，及相应疫苗的研制提出了更为复杂的难题。
致谢：本文得到导师邵一鸣教授的悉心指导，深表感谢。
参考文献
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[4] HIV Databases[DB]. Los Alamos National Laboratory, NIH, US. http://hiv-web.lanl.gov.
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